為什麼酶促反應要嚴格控制時間

Ⅰ 酶促反應中為什麼延長反應時間,最適溫度降低

因為溫度會影響酶的失活速率，有的酶在催化瞬間速率最高時迅速失活。若所需的時間短，就盡量選最高效率；要長時間反應就要盡量保持酶活性。所以要綜合考慮催化效率和失活速率。

Ⅱ 測定酶活力要注意控制哪些條件

1、底物濃度：除選擇適合的底物外，在實際應用中更多考慮的是底物濃度。由於［S］與反應速度V成雙曲線關系，在酶活性測定時，要求［S］達到一定水平以保證酶活性與酶量成正比。

2、酶濃度：在反應條件一定時，酶濃度與反應速度成正比。按照中間產物學說，只有［S］>>［E］時，酶才能被底物分子飽和，反應速度才能達到最大值。因此當標本酶活力過高時，應將標本適當稀釋後再加以測定。

3、溫度：不同的酶最適溫度可以不同，多數酶的最適溫度在37～40℃。高於或低於最適溫度，酶活性都降低。

4、離子強度和pH值：在最適pH時，酶的活性最強，高於或低於最適pH，酶的活性都降低。

一般採用電化學和光物理的方法

即利用反應物或產物的吸光性，用紫外分光光度法或熒光法測定。若酶反應過程中產物或反應物有氣體，則可用測壓儀(瓦氏呼吸儀)測定。若反應過程中生成酸，則可用電化學法。用同位素標記的底物則可用放射化學法測定底物濃度變化，計算酶活性。一些性質穩定的酶，也可用高效液相色譜法檢測。

以上內容參考：網路-酶活性測定

Ⅲ 雙倒數法測定米氏常數的實驗中,決定試驗成敗的因素，關鍵因素又是什麼！

1）實驗應在初速度時間范圍內進行；2)配置不同濃度的底物溶液濃度時應該用同一母液進行稀釋，以保證底物濃度的准確性；3）各種試劑的加入時間，加入量應非常精確；4）要嚴格控制酶促反應時間做到准確無誤；5）要將酶液稀釋到恰當的濃度；6）作圖要准確。

Ⅳ 酶促反應的最適溫度為什麼和反應時間有關

因為溫度會影響酶的失活速率，有的酶在催化瞬間速率最高時迅速失活。若所需的時間短，就盡量選最高效率；要長時間反應就要盡量保持酶活性。所以要綜合考慮催化效率和失活速率。

Ⅳ 在PH值相同的情況下,酶促反應所需時間主要與哪些因素有關

ph值對酶反應活力的影響
1、
酸或鹼可以使酶的空間結構破壞，引起酶的活力喪失，這種喪失活力可以是可逆的或者是不可逆的，對可逆的來說，改變ph值後可使活力恢復。
2、
酸或鹼影響酶的活性部位催化基團的離解狀態，使得底物不能分解成產物。
3、
酸或鹼影響酶的活性部位結合基團的離解狀態，使得底物不能和它結合。
4、
酸或鹼影響底物的離解狀態，或使底物不能和酶結合。
由於上述種種原因，各種酶的作用都有一個最適合的ph值范圍。
用酶活力對ph值作圖，往往是鍾罩形曲線。最適合的ph值還隨著底物濃度、溫度和其他條件的變化而變化，因此確定最適合的ph值應在所實驗的條件下測得。
需要指出的是：
酶的最適ph不是一個特徵性常數不同種類的酶，其最適合的ph值范圍不同；
同一種酶，來源不同，其最適合的ph值也有差異；
同一種酶由於作用底物不同，酶最適合的ph值也不同；
同一種酶作用於同一底物，隨著溫度等條件變化，最適合的ph值也有變化
如唾液澱粉酶最適ph為6.8，但在磷酸緩沖溶液中，其最適ph為6.4—6.6，而在乙酸緩沖溶液中則為5.6。總之，不同的酶在不同的ph值范圍不僅穩定性不同，而且活力也不同，在最適合的ph值內活力最強，這是酶的一個重要特徵，要仔細控制。
下面是具體的實驗步驟在連接里~

Ⅵ 溫度稍高使酶活性下降，為什麼能恢復

酶是生物催化劑,升高溫度在提高反應速度的同時也增加酶變性失活的機會.
一般來說,溫度升高到60℃以上時,大多數酶開始變性,80℃時,多數酶的變性已經不可逆轉。
綜合這兩方面因素,酶促反應速度最大時的環境溫度稱為酶促反應的最適溫度。
酶的最適溫度不是酶的特徵性常數,它與酶促反應時間有密切關系：酶可以在較短的時間內耐受較高的溫度；相反,延長反應時間,酶的最適溫度則下降.另外,雖然酶在低溫下的活性降低,但一般不引起酶的變性,溫度上升後,酶又可以恢復活性,因此生化實驗測定酶活性時,應嚴格控制反應液的溫度。

Ⅶ 酶活力測定中為什麼各樣品與底物測定的時間要嚴格一致

酶活力測定中各樣品與底物測定的時間要嚴格一致，是為了保證在酶的穩定反應狀況之下獲取可比數據。

酶活力常用其催化某一化學反應的能力來表示。通過作出反應曲線可以用線上任何一點的斜率去表徵該時間上的反應速率。在這些酶促反應中，只有初始階段產物生成量與反應時間呈線性關系。換言之，酶促反應初始速度是不變的。隨著時間的延長，斜率逐漸降低曲線上升趨緩，反應速度降低，此時測得的不是真實的酶活力。

另一方面，隨著反應時間推移，反應物濃度降低產物濃度增加，它加速了逆反應的進程，並產生對酶的抑制。故測定酶活力應該測定酶促反應的初速率，在其線性范圍里進行測定。

所以，在酶活力測定中各樣品與底物測定的時間要控制嚴格一致，使之均處於線性范圍和穩定的初速度之中，以保持兩組數據之間穩定的相關性和可比性。

Ⅷ 生化試驗 測定酶活力時需要對試劑、作用時間等嚴格控制

澱粉酶活力的測定
一、目的

學習和掌握測定澱粉酶（包括α-澱粉酶和β-澱粉酶）活力的原理和方法。

二、原理

澱粉是植物最主要的貯藏多糖，也是人和動物的重要食物和發酵工業的基本原料。澱粉經澱粉酶作用後生成葡萄糖、麥芽糖等小分子物質而被機體利用。澱粉酶主要包括α-澱粉酶和β-澱粉酶兩種。α-澱粉酶可隨機地作用於澱粉中的α-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使澱粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。β-澱粉酶可從澱粉的非還原性末端進行水解，每次水解下一分子麥芽糖，又被稱為糖化酶。澱粉酶催化產生的這些還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，其反應如下：

澱粉酶活力的大小與產生的還原糖的量成正比。用標准濃度的麥芽糖溶液製作標准曲線，用比色法測定澱粉酶作用於澱粉後生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時間內生成的麥芽糖的量表示酶活力。

澱粉酶存在於幾乎所有植物中，特別是萌發後的禾穀類種子，澱粉酶活力最強，其中主要是α-澱粉酶和β-澱粉酶。兩種澱粉酶特性不同，α-澱粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速鈍化。β-澱粉酶不耐熱，在70℃15min鈍化。根據它們的這種特性，在測定活力時鈍化其中之一，就可測出另一種澱粉酶的活力。本實驗採用加熱的方法鈍化β-澱粉酶，測出α-澱粉酶的活力。在非鈍化條件下測定澱粉酶總活力（α-澱粉酶活力+β-澱粉酶活力），再減去α-澱粉酶的活力，就可求出β-澱粉酶的活力。

三、實驗材料、主要儀器和試劑

1．實驗材料

萌發的小麥種子（芽長約1cm）

2．儀器

（1）離心機

（2）離心管

（3）研缽

（4）電爐

（5）容量瓶：50mL×1, 100mL×1

（6）恆溫水浴

（7）20mL具塞刻度試管×13

（8）試管架

（9）刻度吸管：2mL×3, 1mL×2, 10mL×1

（10）分光光度計

3．試劑（均為分析純）

（1）標准麥芽糖溶液（1mg/mL）：精確稱取100mg麥芽糖，用蒸餾水溶解並定容至100mL。

（2）3,5-二硝基水楊酸試劑：精確稱取3,5-二硝基水楊酸1g，溶於20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解後用蒸餾水定容至100mL。蓋緊瓶塞，勿使CO2進入。若溶液混濁可過濾後使用。

（3）0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液

A液：（0.1mol/L 檸檬酸）：稱取C6H8O7·H2O 21.01g，用蒸餾水溶解並定容至1L。

B液：（0.1mol/L檸檬酸鈉）：稱取Na3C6H5O7·2H2O 29.41g，用蒸餾水溶解並定容至1L。

取A液55mL與B液145mL混勻，既為0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液。

（4）1%澱粉溶液：稱取1g澱粉溶於100mL 0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液中。

四、操作步驟

1．麥芽糖標准曲線的製作

取7支幹凈的具塞刻度試管，編號，按表1加入試劑：

表1 麥芽糖標准曲線製作

試 劑
管 號

1
2
3
4
5
6
7

麥芽糖標准液（mL）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0

蒸餾水（mL）
2.0
1.8
1.4
1.0
0.6
0.2
0

麥芽糖含量（mg）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0

3,5-二硝基水楊酸（mL）
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0

搖勻，置沸水浴中煮沸5min。取出後流水冷卻，加蒸餾水定容至20mL。以1號管作為空白調零點，在540nm波長下比色測定光密度。以麥芽糖含量為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標准曲線。

2．澱粉酶液的制備

稱取1g萌發3天的小麥種子（芽長約1cm），置於研缽中，加入少量石英砂和2mL蒸餾水，研磨勻漿。將勻漿倒入離心管中，用6mL蒸餾水分次將殘渣洗入離心管。提取液在室溫下放置提取15～20min，每隔數分鍾攪動1次，使其充分提取。然後在3 000r/min轉速下離心10min，將上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為澱粉酶原液，用於α-澱粉酶活力測定。

吸取上述澱粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為澱粉酶稀釋液，用於澱粉酶總活力的測定。

2． 酶活力的測定：取6支幹凈的試管，編號，按表2進行操作。

表2 酶活力測定取樣表

操 作 項 目 α‑澱粉酶活力測定 β-澱粉酶活力測定

Ⅰ- 1 Ⅰ- 2 Ⅰ- 3 Ⅱ- 4 Ⅱ- 5 Ⅱ- 6

澱粉酶原液（mL） 1.0 1.0 1.0 0 0 0

鈍化β-澱粉酶 置70℃水浴15min，冷卻

澱粉酶稀釋液（mL） 0 0 0 1.0 1.0 1.0

3,5-二硝基水楊酸（mL） 2.0 0 0 2.0 0. 0

預保溫 將各試管和澱粉溶液置於40℃恆溫水浴中保溫10min

1%澱粉溶液（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

保溫 在40℃恆溫水浴中准確保溫5min

3,5-二硝基水楊酸（mL） 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0

將各試管搖勻，顯色後進行比色測定光密度，記錄測定結果，操作同標准曲線。

五、結果計算

計算Ⅰ- 2、Ⅰ- 3光密度平均值與Ⅰ- 1光密度之差，在標准曲線上查出相應的麥芽糖含量（mg），按下列公式計算α- 澱粉酶的活力。

計算Ⅱ- 2、Ⅱ- 3光密度平均值與Ⅱ- 1光密度之差，在標准曲線上查出相應的麥芽糖含量（mg），按下式計算（α＋β）澱粉酶總活力。

β-澱粉酶活力＝（α＋β）澱粉酶總活力－α-澱粉酶活力

六、附 注

（1）樣品提取液的定容體積和酶液稀釋倍數可根據不同材料酶活性的大小而定。

（2）為了確保酶促反應時間的准確性，在進行保溫這一步驟時，可以將各試管每隔一定時間依次放入恆溫水浴，准確記錄時間，到達5min時取出試管，立即加入3,5-二硝基水楊酸以終止酶反應，以便盡量減小因各試管保溫時間不同而引起的誤差。同時恆溫水浴溫度變化應不超過±0.5℃。

（3）如果條件允許，各實驗小組可採用不同材料，例如萌發1d、2d、3d、4d的小麥種子，比較測定結果，以了解萌發過程中這兩種澱粉酶活性的變化。

推薦網址：
http://www.estarch.com/news/26/news_6498.html
http://www.bbioo.com/bio101/2006/7201.htm
http://www.scuta.e.cn/yuanxi/bylw/syzd/srdsyzdsy18.htm

Ⅸ 細菌內毒素不同實驗條件對結果的影響

細菌內毒素檢查是一復雜的酶促反應過程，檢查條件的任何變化都會對實驗結果產生影響。中國葯典附錄」細菌內毒素檢驗法「項下明確規定：
1、反應溫度37℃±1℃，時間60min±2min。反應時間與溫度一定要嚴格控制好，否則會得出錯誤結論。如果反應溫度或反應時間不足都會-----出現假陽性；同時反應溫度或反應時間超出葯典規定會-----出現假陰性。
2、葯典規定該試驗應在1萬級環境內的100級區域下進行。然而對試驗室溫度要求在檢查項下未做明確規定，但從中國葯典凡例三十條4項下：除另有規定外應以25℃±2℃為准。
我本人認為試驗環境沒有必要控制在1萬級環境內局部100級區域下進行，因這種環境反而易污染內毒素（原因：以前試驗時污染的內毒素溶液揮發後易從風口吹出）。但實驗室溫度最好控制在20℃以下，這是一個酶促反應，溫度對其影響比較大。
3、供試品溶液的pH值、離子濃度、鱟試劑的靈敏度及操作人員的操作水平等因素都會影響到試驗結果。
因此，中國葯典2015年版開始對「細菌內毒素檢查」做了較大修改：
① 做「鱟試劑靈敏度復核」試驗。該試驗的目的不僅是考察鱟試劑的靈敏度是否准確，也是考察檢驗人員操作方法是否正確及實驗條件是否符合規定的一次考核；
② 「干擾試驗」，當一個新的葯品制訂「質量標准」時或生產企業的原料來源、配方和生產工藝發生變化時都應做「干擾試驗」；消除干擾的方法一般採用BET水稀釋或加酸鹼調節pH的方法消除干擾。其目的是確證供試品在該試驗濃度及試驗條件下對鱟試劑與細菌內毒素的反應無干擾作用。
③ 平時做「細菌內毒素檢查」試驗時，分別做：供試品2管；PPC2管；陽性對照2管；陰性對照2管。並且規定當陽性對照管、PPC管都為陽性且陰性對照管都為陰性時實驗才可認為有效。否則，實驗結果無效。
原因：如果陽性對照管不是陽性，=====出現該問題的原因最大可能性是出在「細菌內毒素標准溶液的制備」第一步，內毒素標准品或工作標准品加BET水復溶是很關鍵的一步，一定要按葯典操作，既加BET水後在振盪器上振盪，15min，否則內毒素混合不均勻會出現這種清況；其次是更換不同批號或不同廠家的鱟試劑或BET水後，一定要做鱟試劑靈敏度復核試驗，否則不知該批鱟試劑靈敏度及檢查用水是否符合要求。-
--------陰性對照管不是陰性說明BET水有污染。
---------PPC管應顯陽性，而未顯陽性說明供試品或供試品稀釋液在該試驗條件下對試驗有干擾。
如對細菌內毒素檢查法感興趣，你可以用「網路」搜索下近年來我在《中國葯師》、《中國葯業》、〈海峽葯學〉等專業雜志上發表的有關細菌內毒素檢查內容的文章，「得力生注射液細菌內毒素檢查法的探討」、「吡拉西坦細菌內毒素檢查方法的建立」、「長春西汀葡萄糖注射液細菌內毒素檢查法的研究」、「地塞米松磷酸鈉原料葯細菌內毒素檢查法的建立」、「利巴韋林細菌內毒素檢查法的建立」、「維生素C注射液細菌內毒素檢查中干擾問題的探討」等論文，以加深對該問題的理解。

Ⅹ 酶促反應中：酶促反應的速度、底物濃度、酶濃度、反應時間的關系

酶促反應速度V
,底物濃度S
,酶濃度E
,反應時間T,
產物濃度P
,米氏常數Km
研究酶促反應是為了測定酶活力，而所說的酶促反應速度是指初速度。
酶促反應速率曲線圖（P-T）表明，在最初T內，P與T呈直線關系，即V保持不變，隨著T延長，V下降。原因是：逆反應加速，PH的改變影響酶活力，產物對酶的抑制等。要排除上述干擾，測酶活時只能用直線部分，即初速度。
在任何S下，V都與E成正比
初V與T無關
當S<<Km時，V與S成正比
當S>>Km時，V=Vmax