液质方法为什么重现性不好

‘壹’ 1. 液质联用的ESI源的质谱图与气质联用EI源的质谱图有什么区别 2. MRM进行定量的优越性是什么

莫非你也是SMU的？
EI的原理：样品以气体形式进入离子源，灯丝发出的电子轰击样品分子使之发生电离；一般电离电压：70eV
其特点是
1、样品分子在电子轰击下，可以失去一个 电子 形成分子离子，也可能化学键断裂形成碎片离子；分子离子给出分子量，碎片离子给出分子结构信息；
2、EI源碎片离子多，结构信息丰富，有标准化合物质谱库
3、样品在气态下电离，不能汽化的样品不能分析，主要用于气-质联用仪
4、有些样品得不到分子离子
ESI的原理是喷雾蒸发，在蒸发过程中表面电荷密度增加，超过临界值后，离子就可以从表面蒸发出来，通过加速电压进入分析器。
其特点是
1.电喷雾源属软电离技术，只产生分子离子，不产生碎片离子；
2.产生的离子常带有多电荷，尤其是生物大分子
3.适用于强极性，大分子量的样品分析；如肽，蛋白质，糖等
4.主要用于液相色谱-质谱联用仪

‘贰’ 【代谢组学】现代仪器分析技术—代谢组学技术基础及原理

        代谢组学隶属于组学范畴之内，目前关注度颇高，它是了解小分子代谢物质（相对分子质量小于1000）数量、种类、丰度的研究技术，可以对小分子物质进行全面的定性及定量分析，并寻找代谢物与环境因子变化的相对关系。然而，代谢组学涉及到的技术原理相对比较广泛，运用的技术手段不同，原理也略有不同。究其基本原理，则涉及到《现代仪器分析》这门学科，该学科下的波谱分析技术和色谱分析技术，是目前代谢组学应用的基础原理，主要目的是进行物质分离和物质分析。在此，我们汇总了，现代仪器分析学科中与代谢组学相关的技术原理，并分享给大家，以便于大家更好地理解代谢组学及其代谢组学研究开展的方式和方法。

主要内容：

1.  仪器分析技术概念及种类

2.  代谢组学涉及的仪器分析方法

    a）波谱分析法        b）色谱分析法

3.  分析仪器联用技术（GC-MS、LC-MS、……）

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1. 仪器分析技术概念及种类

1.1 什么是仪器分析技术

现代仪器分析技术:  采用比较复杂或特殊的仪器设备，以测量物质的物理或物理化学性质的参数及其变化来获取物质的化学组成、成分含量及化学结构等信息的一类方法。

1.2 仪器分析技术的分类

a.波谱分析：紫外可见分光光谱（UV）、核磁共振波谱分析（NMR）、 质谱分析（MS ）……

b.色谱分析： 液相色谱 、 气相色谱 ……

c.物相分析：磁选分析法、比重法、X射线结构分析法…… 

d.元素分析：电镜能谱分析(EDS)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)……

2. 代谢组学涉及的仪器分析方法

一、波谱分析法

主要原理：光的波粒二象性。

光与物质的相互作用： 

    •分子能级：分子处于特定的状态，具有一定的能量； 

     •分子能级跃迁：分子吸收能量从低能级向高能级跃迁；

    •分子光谱：分子吸收能量发生跃迁，吸收光子的波长和吸收信号强弱，为分子吸收光谱，反之，为分析发射光谱。

光谱的分类：分子平移、分子转动、化学键振动、电子能级跃迁、电子自旋、同位素原子核自旋。

1  核磁共振波谱（NMR）

NMR： 一种研究原子核在磁场中能级及其跃迁的波谱方法。—分子结构和分子间关

基本原理：

    •原子核的自旋运动：只有自旋不为零的核才能与外磁场发生作用，具有核磁共振的条件；

    •核动量矩和磁矩的空间量子化（原子核在外磁场中的行为）：在强磁场的激励下，一些具有某些磁性的原子核的能量可以分为2个或2个以上的能级。 

    •核磁共振产生：此时，外加一个能量，使其恰好等于裂分后相邻两个能级之差，则该核可能吸收能量（称为共振吸收）。  

从低能态向高能态，所吸收的能量的数量相当于频率范围在0.1~100MHz的电磁波（属于无线电波范畴，射频），因此，NMR就是研究磁性原子核对射频能的吸收。

1.1  弛豫过程—谱线宽度

纵向弛豫（自旋-晶格弛豫）：高能态的核与周围环境（固体晶格、液体中的溶剂分子等）进行能量交换的过程。  

横向弛豫（自旋-自旋弛豫）：高能太的核将能量传递给相邻低能态自旋核的过程。  

谱线宽度的影响因素：弛豫时间、仪器磁场的均匀性、顺磁性物质。

1.2  化学位移δ

化学位移：原子核所处的化学环境不同，受到核外电子屏蔽作用不同，其共振频率各不相同，共振吸收峰将分别出现在NMR谱的不同频段区域或不同磁场区域。  

化学位移的表示方法：相对位移，以某种物质（TMS）的共振峰为原点，测序样本中质子共振峰与原点的相对距离。——数据的统一。

1.3  核磁共振仪

仪器的分类： 

    •射频频率：60MHz，100MHz，600MHz…… 

    •磁体类型：永磁，电磁，超导磁体…… 

    •射频源：连续波、脉冲傅里叶变换…… 

仪器结构：

2. 质谱（MS）

质谱法 即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片，有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子－分子相互作用产生的离子）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。

应用： 化合物结构、定性和定量化学分析……

2.1  采用质谱法的原因

测出离子准确质量即可确定离子的化合物组成。由于核素的准确质量是一多位小数，决不会有两个核素的质量是一样的，而且决不会有一种核素的质量恰好是另一核素质量的整数倍。

2.2  基本原理

    样本进入质谱仪器，在质谱仪离子源中，化合物被电子轰击，电离成分子离子和碎片离子，这些离子在质量分析器中，按质荷比大小顺序分开，经过电子倍增器检测，即可得到化合物的质谱图。

2.3  质谱图

横坐标：质荷比 

纵坐标：离子强度 

离子绝对强度：样本量和仪器的灵敏度 

离子相对强度：样本分子结构相关 

同一样品，在一定的电离条件下得到的质谱图是相同的。这是质谱进行有机定性分析的基础。

​ 2.4  MS仪主要结构

二、色谱分析法

一种分离、分析方法； 

特点： 有两相—固定相、流动相，两相相对运动。

分离原理： 当流动相中所携带的混合物通过固定相时，会和固定发生作用，由于流动相中各组分性质和结构的差异，与固定相之间作用力的大小也有差异。因此，在同一推动了作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同次序从固定相中留出。

1.1组分分离的影响的因素

1.2色谱的基本理论

A.色谱分配平衡

色谱分配平衡：组分在固定相和流动相之间发生的吸附，脱附或溶解、挥发等作用的过程—分配过程。在一定温度下组分在两相间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数；质量比称为分配比。

分配系数：色谱分离的实质。

B. 塔板理论

塔板理论借助于化工中的塔板理论概念推导出流出曲线方程。

        将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相占据，另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作一个理论塔板（theoreticalplate），一个理论塔板的长度称为理论塔板高度（theoretical plateheight）H。经过多次分配平衡，分配系数小的组分，先离开蒸馏塔，分配系数大的组分后离开蒸馏塔。由于色谱柱内的塔板数相当多，因此即使组分分配系数只有微小差异，仍然可以获得好的分离效果。

a）组分浓度与时间的关系：流出曲线方程

解释的问题： 色谱峰图形和最大浓度位置。

b）色谱柱的理论塔板高度为单位柱长度的色谱峰方差

理论塔板高度越低，在单位长度色谱柱中就有越高的塔板数，则分离效果就越好。

决定理论塔板高度的因素有：固定相的材质、色谱柱的均匀程度、流动相的理化性质以及流动相的流速等。

c）理论塔板数&有效塔板数

有效塔板数：取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。

d）塔板理论的特点与不足

塔板理论方程符合色谱流出曲线，为色谱理论提供指导  

用（有效）塔板数和（有效）塔板高度衡量柱效能指标时，应指明特定物质（不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同）。 

没有阐明影响柱效的本质

    •柱效不能表示被分离组分的实际分离效果； 

    •无法指出影响柱效的因素和提高柱效的途径。 

解释不了载气速率对理论塔板数的影响 

    •无法解释同一色谱柱在不同载气速率下柱效不同的实验结果。

C. 速率理论

速率理论认为： 单个组分分子在色谱柱内固定相和流动相间要发生千万次转移，加上分子扩散和运动途径等因素，它在柱内的运动式高度不规则的，是随机的，在柱中随流动相前进的速率是不均一的。

​ a）范第姆特方程式（VanDeemeter速率理论方程）

b）A—涡旋扩散项

f）改善柱效的措施

选择颗粒较小的均匀填充料；

在不使固定液粘度增加太多的前提下，应在尽可能低的柱温下操作；  

用最低实际浓度的固定液； 

用较大分子量载气； 

选择最佳的载气流速；采用较小内径和较大曲率半径的柱形。

D. 分离度

分离度：描述物质实际分离效能（塔板理论和速率理论难以描述）。  

分离度影响因素：热力学因素（保留值）、动力学因素（峰宽、柱效）。 

分离度的情况： 

①柱效较高，分配系数较大，完全分离； 

②分配系数不是很大，柱效高，峰较窄，基本上完全分离； 

③柱效较低，分配系数较大，但分离不好； 

④分配系数小，柱效低，分离效果差。

​ 1.3 气相色谱（GC）

以气体为流动相的色谱分析方法：  

适合于分离分析易气化、稳定、不易分解、不易反应的样品，特别适合同系物，同分异构体的分离。

a）气相色谱的基本原理

b）气相色谱仪（GC）及其主要结构

1.4  高效液相色谱（HPLC）

以液体为流动相的色谱法； 

适合于分离高沸点，热不稳定，离子型的样品。 

经典LC：分离手段；HPLC：分离和分析。

基本原理： 色谱过程中不同组分在相对运动，不相混溶的两相间进行交换，相对静止的一相为固定相，相对运动的相为固定相，利用吸附，分配，离子交换，亲和力或分子大小等性质的微小差别，经过连续多次在两相间进的质量交换，使不同组分得到分离。

四种类型： 吸附色谱，分配色谱，凝胶色谱，离子色谱。

a）液相色谱仪主要及其主要结构

3. 分析仪器联用技术（GC-MS、HPLC-MS……）

3.1 分析仪器联用技术概述

分析仪器联用技术：将两台或多台分析仪器结合到一起使用的技术，得到快捷、有效的分析工具。 

色谱最大特点是能将复杂的混合物分离成单一组分，但定性和结构能力较差。

质谱等技术对一个纯组分结构确定较为容易。

分析仪器联用形成对混合物质的完整分析。

3.2 分析仪器之间联用的重要问题

接口问题，其一般要求如下：•可进行有效的样品传递； 

    •样品传递要有良好的重现性； 

    •容易满足两个仪器任意选用的操作模式和条件； 

    •样品通过接口不发生化学变化； 

    •不影响仪器效能； 

    •样品经过接口的速度尽可能快； 

    •接口本身操作简单、方便、可靠。

3.3 气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术

综合GC和MS的有点，具有GC的高分辨率和质谱的高灵敏度、强鉴别能力。  

适宜小分子，易挥发，热稳定，能气化的化合物；  

用电子轰击方式（EI），得到的谱图可以跟标准谱图库比对。

3.4 高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用技术

液质联用（LC-MS）可以解决如下几方面问题：

    •不会发化合物分析测定； 

    •极性化合物的分析测定；

    •热不稳定化合物的分析测定；

    •大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定； 

    •没有商品话的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析图谱。 

要解决的重要问题： 

    •液相色谱流动对质谱工作条件的影响； 

    •质谱离子源的温度对液相色谱分析源的影响。

3.5 GC-MS& LC-MS 联用技术仪器的主要结构

‘叁’ 有液质质谱平台，方法学建立太难啦，怎样才可以更快的把平台使用起来做代谢组学检测

如果有相应的试剂盒产品，可以直接购买，然后按照产品参数开发方法，更方便更快速。

‘肆’ 液质检测中，萃取浓缩后，为什么要净化，净化的目的是什么

使用商品固相萃取小柱来进行样品提取液净化浓缩的方法。工作原理与柱色谱法相似。集萃取、净化、浓缩于一步，具有缩短分析时间，降低成本，节省有机溶剂，可实现半自动化、全自动化操作。由于是商品化生产，固相萃取小柱规格统一，装填均匀，操作方便，易于控制，所以该方法重现性好。

‘伍’ 液质方法优化的步骤

GC-MS是气相色谱仪经接口与质谱计结合而构成的气相色谱－质谱法的分析仪器，GC-MS中气相色谱仪相当于质谱仪样品预处理器，而质谱仪则是气相色谱的检测器，通过接口将二者有机地结合。 因此，接口是色谱-质谱联用技术的关键装置。

液质联用（HPLC-MS）又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。

介绍

色谱的优势在于分离，为混合物的分离提供了最有效的选择，但其难以得到物质的结构信息，主要依靠与标准品对比来判断未知物，对无紫外吸收化合物的检测还要通过其它途径进行分析。质谱能够提供物质的结构信息，用样量也非常少，但其分析的样品需要进行纯化，具有一定的纯度之后才可以直接进行分析。因此，人们期望将色谱与质谱联接起来使用以弥补这两种仪器各自的缺点。

以上内容参考：网络-液质联用

‘陆’ 食品安全检测结果要怎么看呀，没有参照物对比，判断依据怎么看呢

日常检测中，食品检验不仅向社会出具具有证明作用的数据结果，还要作出合格与否的判定。准确的检验结论体现了食品安全状况，是监管部门执法的重要依据，影响公众对食品安全的信心。因此，食品检验结果的符合性判定至关重要，要充分体现准确性、科学性、客观性等。

判定与很多影响因素有关，一是样品采集和保存，涉及数量和运输存储条件的要求;二是样品制备，涉及制样中样品和指标的代表性、均匀性、稳定性保证;三是检验数据结果的准确性;四是判定标准应用的合理性和一些基本原则的应用;五是样品分类与判定标准的匹配性等。

样品采集要注意样品的代表性和均匀性，要注意液体样品采集的不同位置，尽量保证检验样品和复检备样的一致。另外，要熟悉掌握各品种指标规定检测方法的数量和包装要求，能满足检验和复检备样要求。

必要情况下，还需要采用无菌操作开展采样。同时，产品有特殊储存条件要求的，须有相应有效的保障措施，保证能符合产品明示要求或产品实际需要。样品采集后进入实验室检验，也要保证环境条件满足样品明示保存条件，尤其针对微生物项目。

样品制备作为检验的首要关键环节，与很多因素有关。为降低因制样因素导致的判定风险，需要关注以下几个方面。

01 检测方法对制样的规定

如黄曲霉毒素B1（GB 5009.22）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（GB 5009.111）、氯霉素（GB/T 18932.19）等检验标准对样品包装个数、样品量、样品预处理等均作了要求。

02 判定标准对制样的规定

要注意制样的取样部位，尤其注意不同类型指标的差异性，如污染物（GB 2762）和真菌毒素（GB 2761）限量标准要求取样品的可食用部位；农残限量标准（GB 2763）规范性附录A 明确了食品类别及测定部位；兽药残留限量标准（GB 31650）在对应化合物指标的限量表中明确了靶组织，如鱼中的恩诺沙星靶组织为皮加肉；部分产品标准，如方便面（GB 17400）规定理化指标测面饼，而微生物指标测面饼和调料的混合物。

03 要关注指标本身的稳定性

对于易变化的指标，如酸价、过氧化值、挥发性盐基氮、农残、亚硝酸盐等，应优先制样检验并做好稳定性保存，以避免检验结果随样品的储存条件或放置时间而变化。

04 要注意制样的代表性和均匀性

制样时应选择合适的粉碎设备，尽量保证样品的均匀性。如，农产品的不同个体或同一个体不同部位的农兽药残留有差异；香辛料样品包装中不同的香辛料对重金属的富集有差异等。此外，特别要注意防止制样中因人员、接触器具、工具等带入的污染，如木质菜板的五氯酚酸钠、油性记号笔的孔雀石绿；制样人员带入的污染，如手部涂抹氯霉素软膏、甲硝唑软膏直接接触样品。

一是方法的合规性，即所采用的方法是否与判定标准的要求匹配。农药残留、污染物及真菌毒素等基础标准均指定了相应的检验方法，在用到该基础标准作符合性判定时，须采用匹配的检验方法。

二是方法本身对于检测结果的影响。对于有多个标准或是标准中有多个方法可选择时，要注意理解方法原理、方法间的差异，针对不同的样品基质选择合适的方法，以确保检测结果的准确可靠。如，酒类甜蜜素的测定，需采用液相或液质法，是由于气相色谱法测定时酒中的其他成分会产生干扰，导致假阳性结果。此外，在日常检验过程中，机构还应特别注意是否具备方法资质，方法是否及时变更确认等，以避免超资质范围出具检验报告。

食品检验是痕量分析，受很多因素影响，如基体干扰、基质效应、过程污染、定性准确等系统性问题。

一方面食品检验过程质量控制方式的设计和结果的评价尤其重要，涉及空白（全试剂空白、样品空白等）、关键点加标回收、阳性样品、阴性样品、在线监控抗污染和分析系统稳定性等方式。过程质量控制需采取有效针对性方式，一般建议元素类可采取有证标准物质；食品添加剂及农药残留类可采取加标方式；兽药残留尤其存在结合型情况下，建议采用真实阳性样品或实验室间进行比对开展监控。

另一方面是对检验结果的客观评估，特别关注可能的基质干扰问题。实际检验中发现，酱腌菜中三氯蔗糖、蜜饯中山梨酸、饮料中展青霉素、菜籽油中的 TBHQ 可能存在干扰，首选需要识别出干扰，可通过更换不同方法或前处理、更换色谱柱或调整流动相比例、采用质谱手段进一步确认。批量性检出或是结果异常时，需对试剂试药、仪器设备、器具耗材及操作过程等逐一排查。要重视结果的重现性及平行性。重现性及平行性能提示检验存在问题，如前处理过程是否恰当（提取、衍生是否充分，洗脱是否完全等）、样品是否均匀、基质是否有干扰等。

食品标准体系复杂，标准应用要充分了解标准的基本应用原则。

首先是标准的时效性

需要理清标准发布实施日期与样品生产日期的逻辑关系、不同标准的时效性差异等。

二是标准的执行效力

理清强制标准与推荐性标准、基础标准与产品标准/地方标准/企业标准的优先级及执行条件。

三是标准的适用范围

只有适用范围内的样品才可用此标准判定，如 GB2712-2014《食品安全国家标准 豆制品》只适用于预包装豆制品，不适用于大豆蛋白粉。

此外，还要关注标准间的衔接整合

如基础标准对推荐性标准和产品标准进行了整合，发布/实施日期在基础标准之前的推荐性标准和产品标准，其规定与基础标准不一致时，应以基础标准为准。

如速冻面米制品产品标准（GB 19295-2011）对预包装的生制速冻面米制品设置了致病菌限量，而致病菌基础标准（GB 29921-2013）未作规定，两者不一致。但由于速冻面米制品产品标准的发布实施日期在基础标准之前，因此，要以基础标准为准，无需对生制速冻面米致病菌进行检验和判定。

检测狮实验室信息管理系统（LIMS）满足ISO/IEC：17025体系的全部要求，对实验室的资源、样品、分析任务、实验结果、质量控制等进行合理有效的科学管理。检测狮，让检测更高效

‘柒’ 食药监总局：食用织纹螺当心河鲀毒素,河鲀毒素有什么可以控制的和检测的

河纯毒素在发现之初人们就在不断寻找其更好的检测方法。河鲀毒素检测常用的方法有小鼠检测法、酶联免疫法、薄层色谱法、柱后衍生高效液相色谱检测法、气质联用法和液质联用等。国外较多地采用气质联用、液质联用的方法检测河鲀毒素。
小鼠生物法（以30分钟内将一体重20克小鼠致死所用河纯毒素的量为一鼠单位）是最常用、最直观的检测方法，通过小鼠死亡前所呈现出的典型的河鲀毒素中毒症状，可迅速地将河鲀毒素与其它致死性物质区分开。最早对河毒素进行定量分析研究是在1941年，当时斯坦福大学在研究蝾螈毒素时引进了鼠单位（Mouse unit，MU）概念。其原理是，一定体重的小鼠经腹腔注射TTX后，其死亡时间的倒数与注射TTX剂量之间存在着线性关系，因此可根据小鼠死亡时间推断TTX的含量。此法测得的毒力用小鼠单位（mouse unit，MU）表示。黄登福等采用同样的方法，使用ICR品系小鼠建立了测试TTX毒素的方法，1MU=0.178μgTTX。但实际使用时因个体差异大、重现性不好，而且需有一定规模才能客观反映实验结果，因此该法的应用受到限制。
免疫酶技术是20世纪60年代发展起来的新的免疫测定法，它是抗原抗体的免疫反应与酶的高效催化作用原理的有机结合。Watabe等首先于1989年建立了用牛血清白蛋白（BSA）连接河鲀酸（TDA）作为抗原的酶联免疫吸附检测（ELISA）法，检出限为0.3-1000.0mg/L。[82] 李世平等应用小鼠生物试验和间接竞争抑制酶联免疫吸附试验（ELISA）同步检测17份河鲀肝组织和20份河鲀肌肉组织中的河鲀毒素含量，并对2种方法的检测结果进行比较。结果表明，ELISA法与小鼠生物试验法测得的结果相符合。由于ELISA法测定程序简便易行，速度快，灵敏度高，因而在河鲀毒素的定量检测以及预防河鲀中毒方面具有广泛的应用前景。
高效液相色谱是分析、制备领域应用最为广泛也最为成熟的技术之一，它具有分离效率高、分辨率好及速度快等特点。张虹等采用醋酸与TTX结合形成离子对在ODS柱上采用紫外检测器直接测定TTX含量，该方法操作简单、快速、准确，最低检测限50ng。[84] 王小逸等还利用蒸发光散射检测器进行TTX测定，该法可用于微克水平河鲀毒素含量的测定。刘海新等采用柱后衍生高效液相色谱法检测水产品中的河鲀毒素含量，样品先由0.1%乙酸提取，再经过C18固相萃取柱净化。以庚烷磺酸钠为离子对试剂，应用反相离子对液相色谱分离河鲀毒素，采用在线柱后衍生系统，荧光检测器定量检测。河鲀毒素在5-1600ng的范围内呈良好的线性相关，相关系数r=0.9997；1、2、8μg/g，3个浓度水平添加样，日内和日间的回收率为80.9-91.2%，相对标准偏差为1.93% -5.57%；方法定量限为1μg/g。高效液相色谱荧光检测器要比紫外检测器具有更低的检测限，而TTX没有荧光吸收，所以必须先要衍生化成具有荧光吸收的物质，操作比较繁琐。
随着质谱技术的发展，质谱所具有的超强定性能力使色谱质谱联用成为分析行业最有效最准确的分析方法之一。1993年SaitoT利用气-质联用从刀鱼中检测到TTX及其同分异构体的存在。Nagashima等利用气-质联用从暗纹东方鲀肝脏含有的高分子物质中检测到河鲀毒素的存在。吴平谷等用2%乙酸/甲醇提取出河鲀毒素，用正己烷脱脂，然后用碱将河鲀毒素水解成2-氨基-8-羟基-6-羟甲基-喹唑啉（C9碱），水解液经过C18、SLH固相萃取柱净化，BSTFA衍生，采用气相色谱—质谱法全扫描方式测定。液相色谱质谱法比气相色谱质谱法具有更广的应用范围，不需要衍生化，大大简化了分析手段。[88] Tsai等采用了液相/质谱联用法来测定河鲀中的TTX。[89] 李爱峰等应用C18反相色谱柱和HILIC亲水作用色谱柱，建立了河鲀毒素（TTX）的液相色谱—电喷雾离子阱质谱联用分析方法。[90] 郑雍怡等建立了在大鼠腹腔注射给药后，测定其血浆中河鲀毒素的高效液相色谱—质谱联用（LC/MS）定量检测方法。[91] 王洪允等建立了LC-MS-MS测定血浆中河鲀毒素的检测方法，其检测限浓度为1ng/mL。
荧光法是最早建立的定量检测TTX的仪器分析方法。1976年，Saito等首先提出了荧光法，原理是加碱水解后生成2-氨基6-羟甲基8-羟基喹唑啉（简称C9碱），该物质发荧光，建立了最早的荧光分析法；其后，又有研究对荧光检测法进行了改进，建立了连续自动荧光分析方法。[93] 但由于荧光分光光度计在中国应用不如紫外分光光度计普遍，因此根据TTX碱水解生成C9碱的同时定量地生成草酸钠，此结构在紫外区有明显吸收峰的特点，陈玉仁等建立了紫外分光光度法。该法与荧光法相比，二者最低检出限接近，但后者仪器设备较便宜。
Nagashima等建立了薄层色谱快原子轰击质谱的测定方法。先在LHP-K板上进行TLC，纯化TTX及其衍生物，然后用质谱定量，最低检出限为0.1g。此法可以区分在其它TLC方法中难以区分的TTX和脱水TTX，其优点还在于不需TMS硅烷化，甚至当被测物的TLC行为不清时也可以测定。[95] 1988年，王健伟研究建立了不需水解的薄层色谱（TLC）分析方法用于TTX的定量检测。采用火焰离子检测器，不需将TTX降解为C9碱，避免了衍生反应过程中可能存在的干扰。

‘捌’ 竞争机制为什么能提高检测灵敏度

河豚毒素的研究进展（高源）

浩瀚的海洋占地球表面积71.8 % ,占地球总体积的90 %以上,在这个具有巨大时空尺度的开放型复杂体系中蕴藏着种类繁多、数量庞大的海洋生物,据估计生物总种类达30多门50 余万种,生物总量占地球总生物量的87 % ,与陆生植物相比,人们对海洋生物的认识和利用率相当有限。

海洋是大自然赋予天然产物化学家进行药物研究的广阔领域,30余年来各国科学家对海洋生物进行了广泛的研究,从中分离和鉴定出15 000余种海洋天然活性物质,并且每年以600～800 个新天然产物的速度增加。海洋生物的特殊生活环境如高压、高盐度、低营养、低温但恒温以及有限的光照和缺氧等决定了海洋生物的次生代谢产物相对陆生植物的次生代谢产物有其独特的特点。

海洋毒素(Marine Toxin) 是海洋生物活性成分中结构独特活性特强的一大类成分,主要包括聚醚梯、线性聚醚、大环内酯聚醚、生物碱聚醚、肽类和河豚毒素(tet rodotoxin , TTX) 类等,其中对TTX 类化合物的认识最早,研究也较深入。本文主要就TTX 类化合物的各方面研究进展进行总结如下。

一、TTX的研究历史

我国历代本草如《神农本草经》和《本草纲目》中都有河豚的记载。河豚（图1）学名：Fugn rubripes，属硬骨鱼纲，鲀形目，鲀亚目，鲀科，是暖水性海洋底栖鱼类，分布于北太平洋西部，在我国各大海区都有捕获，假睛东方豚还经常进入长江、黄河中下游一带水域，而暗纹东方豚亦可进入江河或定居于淡水湖中。

TTX（图2）又称原豚素 ( spheroidine) 和东方豚毒素(fugu poison) ,是一种神经毒素,它的名字来源于动物东方豚属(fugu)河豚(spheroides rubripes)的科名Tet raodontidae 。

河豚味道鲜美,营养丰富,日本、中国、欧洲等国人民素有食用习惯,由于TTX 毒性很强,因食用河豚中毒事件屡有发生。最初1909 年田原对河豚鱼卵的神经毒性进行了描述并命名其毒性成分为TTX 。1938年日本学者横尾晃,首次从河豚中提取出较纯的毒性成分,到1950 年才分离到单体结晶。随后日本津田恭介小组于1952 年,平田义正小组于1955 年,美国的Woodward 小组于1957年和后来的后藤小组相继分离得到了TTX 单体结晶。

TTX 的分子并不大,其结构新颖,在有机溶剂和水中都不溶解, 仅溶于醋酸等酸性溶剂,并且在碱性和强酸性溶剂中不稳定,加之核磁共振技术在20 世纪60 年代刚刚开始应用,给TTX 的结构鉴定带来了相当的困难。为了确定TTX 的结构,日本的津田、平田和美国的Woodward 3 个小组分别制备了TTX 的衍生物并进行X2衍射实验。终于1964 年在京都召开的国际天然产物化学会议上同时报告了TTX 的正确结构,是一种分子量不大但结构很复杂的笼形原酸酯类生物碱,分子中几乎所有的碳原子均有不对称取代。同年Mosher 从产于加利福尼亚的蝾螈中也分离出TTX。1964 年以前日本和美国学者对TTX 的结构进行了深入的研
究,报道了多个TTX 的可能结构和部分结构。

二、TTX的分布及起源的探讨

1964 年以前,人们普遍认为TTX 仅分布于东方豚中,直到Mosher 从产于加利福尼亚的加州蝾螈中分离出了TTX才改变了人们的认识。研究发现, TTX分布于陆地和海洋的许多动物中,包括毫不相干的脊椎动物,无脊椎动物的体内和体表,甚至海底沉积的生物中,如热带刺鲥鱼,蟾蜍,哥斯达黎加的箭毒蛙，蓝斑章鱼,多棘槭海星,马蹄形蟹,花纹爱洁蟹,腹足纲软体动物如硰罗法海螺,日本东风螺,环节动物以及其他的软体动物和线虫。

既然TTX广泛分布于这么多种的生物体内，那么TTX的起源问题就引起了学者的关注。总结来看关于TTX起源问题，现在有四种假说。分别是内因说、外因说、食物链假说和微生物起源假说。

1、内因假说

主张内因说的学者认为河豚等含有的刺胞、毒腺中的蛋白质毒素是内源性毒素的来源。推测河豚鱼体内有特定功能或微生物能将摄入的食物转化为毒素。Matsumura 用人工授精法从河豚鱼( Fugu ni2phobles) 卵母细胞发育的胚胎中发现河豚毒素的毒性随胚胎发育不断增高,提出TTX 是河豚鱼胚胎的产物但始终没有更多证据证实这种说法,因此内因说没有得到广泛认可。

2、外因假说

外因说是日本学者清水、松居最早提出的。他们用含TTX 的饵料投喂养殖的无毒河豚及人工采苗饲育的河豚,结果发生毒化现象,推测毒素的起源可能是外因性的。

3、食物链假说

食物链假说是由桥本野口发现并提出的，他从海螺、海星及花纹爱洁蟹( A tergatisf lori s) 检出高浓度的TTX ,为食物链起源假说提供了证据。Noguchi 证实白法螺( B oshubora) 体内的毒素是进食了含TTX 的海星积累的,这是食物链假说的又一例证。但这些动物含毒程度为何因地区个体的不同有很大差别呢 毒素起源于含毒饵料假说也有不少难以自圆之处。

4、 微生物起源假说

于是松居提出了TTX微生物起源假说,但当时并无实验证据。微生物起源假说日本安元健从藻食性青点鹦嘴鱼中检出的毒素经氢氧化钠衍生后生成TTX 衍生物22氨基262羟甲基喹唑啉(C9 碱) ;对摄食石灰藻的铜铸熟若蟹的检测证实同样含TTX;而不摄食石灰藻的多毛纲动物也检测到TTX 衍生物,因此认为石灰藻并非原始产毒者,推测石灰藻上可能有共生细菌附着。Nogu2chi 等由石灰藻和毒蟹的内脏分离的假单胞菌属 ( Pseudomonas) 细菌培养液中得到2 个有毒成分,确证分别与河豚毒素及脱水河豚毒素一致,碱液分解也生成C9碱;高压液相,红外光谱、质谱分析确证是TTX;分别注射小鼠腹腔,显示了与河豚毒素和脱水河豚毒素相对应的致率,从而证实TTX是细菌的代谢产物,这是TTX起源于共生微生物的最早证据。迄今已发现很多产TTX 的微生物类群。因此主张微生物起源假说的学者越来越多。

1986 年日本学者野口和安元又首次从微生物发现TTX 。随后众多的微生物如弧菌属、假单胞菌属、发光菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属、芽胞杆菌属、不动杆菌属、链霉菌属等中发现了TTX 及其类似物,从而支持了Mosher 的假设。

三、TTX的生物活性

TTX 是发现最早的小分子海洋毒素,分子量为319(C11H17N3O8) ,毒性极大,LD50为8. 7μg/ kg ,是氰化钠的1000 倍。很多海洋食品中毒事件都与TTX 有关,河豚中毒是鱼类中毒中最为严重的一类,患者病率高达60 %。

TTX中毒的主要临床表现为知觉麻痹、运动障碍、头晕头痛、恶心呕吐、血压下降、呼吸困难、严重者因呼吸衰竭而亡。TTX 还是麻醉剂, 其局部麻醉作用是普鲁卡因(procaine)的4000倍,可作为癌症后期的缓解药。TTX 的作用机理与陆地发现的毒素不同,极低的浓度就能选择性地抑制钠离子通过神经细胞膜,但却允许钾离子通过, TTX 是一种电压敏感的钠通道(voltage2gated sodium channels ,VGSC)外口特异性阻滞剂,神经、肌肉、心肌传导纤维等可兴奋细胞膜生的钠通道,并具有高度专一性,其作用机制是通过与膜上的专一受体结合,再通过关启机制关闭通道,从而阻滞神经细胞的兴奋与传导。（见图3）

TTX 分子中1 ,2 ,32胍氨基及其附近的C4 ,C9 ,C10 碳上的羟基为活性基团。胍氨基在生理条件下通过质子化形成正电活性区域,与专一受体蛋白的负性羟基结合, 其周围羟基以氢键形式与受体结合,受体位于膜外层离子孔附近。

TTX 是神经生物学和药理学研究极为有用的工具药。TTX 还是一种较强的镇痛药,除对术后疼痛无效外,对其他疼痛均有效,作用缓慢且持久,目前还没有成瘾性的报道。

四、TTX的检测方法

近年来,随着渔业的发展,河豚鱼中毒事件的屡次出现,以及当前可能被恐怖分子利用的潜在威胁,使TTX的检测越来越为人们所重视,并具有重要的现实意义。现有的检测方法可分为生物测定法、理化分析法和免疫化学法。本文对各种TTX的检测方法加以简单的介绍,具体的方法已有较详细的文献记录，在此就不重复了。以便利用不同的实验条件对TTX进行快速、准确的检测。

1、生物测定法

包括小鼠生物实验法、竞争置换法、组织培养生物实验法、动电位法。

2、理化分析法

包括荧光法、紫外分光光度法、薄层色谱法及其联用技术、电泳法及其联用技术、气相色谱法及其联用技术、高效液相色谱法及其联用技术。

3、免疫化学检测法

TTX的检测方法很多,每种方法都有其优缺点,可根据实验条件及要求选择恰当的检测方法。TTX作为钠离子通道阻断剂,虽然毒性强,但在临床中也可作为高效镇痛剂,并且对某些肿瘤有抑制作用,在神经生物学、药理学、肌肉生理学等方面被广泛用于工具药。随着TTX检测手段的不断完善, TTX的研究将会有更大的发展,在食品检验、中毒诊断、治疗及国家安全等方面发挥更大的作用。

五、TTX的类似物

除TTX 以外, 从河豚鱼、蟾蜍、金色青蛙、蝾螈、水蜥、扁状蠕虫、贝壳类、海藻、微藻、细菌等水生动物和微生物中分离鉴定了20 余种TTX 的类似物。（见图4）这些化合物都是引起食物中毒的成分,20世纪80 年代在日本、加拿大、荷兰、台湾、香港、新加坡、马来西亚、澳大利亚、美国、孟加拉、菲济等地区发生的多起海鲜中毒事件均与此类化合物有关。

六、TTX的全合成

TTX 独特复杂的结构和显着的生物活性吸引了大批有机化学家对其全合成的兴趣。1972 年日本名古屋大学的岸义人(现哈佛大学教授)首先报道了TTX 消旋体的全合成,随后的30年间虽然对其全合成的研究也有报道,但没有完成全合成的报道,TTX 一直被有机合成化学家认为是一个极富有挑战性和吸引力的,同时也是非常令人可畏的全合成目标。

近年来随着不对称合成有机化学的迅速发展,2003 年名古屋大学的矶部稔教授完成了对TTX 的不对称全合成,随后又有几个小组采用不同的合成路线完成了对TTX 的不对称全合成。（见图5）不对称全合成均采用了逆合成的思路,合成策略。合成的难点是构筑季碳的不对称中心。

相信随着新的不对称合成反应试剂和新的化学反应的发现,对TTX及其类似物的不对称全合成会有新的更为简洁的合成路线和方法。

七、TTX的医药开发前景

1、TTX提取纯化工艺的研究

1909年日本田原良纯首次报道河豚毒素提取工艺，其纯度只有0.2％，随后50年代横尾等又相继报道了改进工艺，我国直到上世纪80年代才由河北省水产研究所与中国人民解放军药物化学研究所共同合作提取成功,于1982年1月9日鉴定通过，打破了日本在这方面的垄断技术。河豚毒素粗品的提取方法大同小异：使用水浸泡、酸提取，盐沉淀除杂质，再用氨水沉淀，得到河豚毒素粗品。随着科技的发展和技术的更新，河豚毒素纯化工艺有很大改进，从田原良纯提取得到的粗品的基础上采用氧化铝柱层析进行纯化，随后又改进为活性炭柱层析纯化等方法。

宫庆理等采用大孔树脂D201和离子交换树脂IRC286进行吸附，用去离子水将杂质洗掉，再用酸将河豚毒素洗脱下来，采用高效液相色谱制备得到高纯度的河豚毒素，纯度为99.5％，粗品精制得率为81.1%，将河豚毒素的纯化工艺又提高了一个层次。目前的提取纯化工艺成熟，在提高产率的同时，又能获得高纯度的河豚毒素，确保了河豚毒素原料的生产。

2、TTX质量控制方法可行性

国内外研究河豚毒素检测方法主要有生物测定法、高效液相色谱紫外检测法（HPLC-UV）、高效液相色谱荧光检测法（HPLCFLD）、高效毛细管电泳法（HPCE）、液质联用、气质联用等方法。生物法有酶联免疫（ELISA）法和小鼠法等。ELISA法具有特异性好、灵敏度高,可定量检测,而且有采样量极小等特点，多用于河豚毒素的痕量检测；小鼠法是利用河豚毒素的毒性特点进行的小鼠毒性检测的方法，方法简便,但定量不准确且重复性差、目标性差，现已少用。

HPLCUV法是常用的检测手段，既可以检测含量，又可以作为有关物质的考察，河豚毒素没有紫外光谱特征吸收，采用末端吸收进行检测；国外多采用柱后衍生化荧光检测的方法进行含量测定，河豚毒素本身没有荧光，氢氧化钠破坏后产生降解产物C9碱具有荧光；荧光检测的灵敏度比紫外检测的灵敏度高，但在含量测定检测结果上两种方法不存在显着性差异。

HPCE法具有高分离度和高柱效的优点，但其有重现性差、灵敏度低、需要加入内标才能定量，在有更好的HPLC检测方法时，HPCE只能作为一个补充方法。具有高灵敏度与选择性的液质联用和气质联用在分析河豚毒素及其类似化合物时显示出了其特有的专属性和高分辨、高灵敏的优越性，也是近几年研究较多的方法，为河豚毒素杂质定性检测提供保障。

国内的研究方法主要是在国外的研究基础上进行的，并没有太大的改进。目前的研究方法足以确保河豚毒素药品的质量检测，很少有报道研究河豚毒素有关物质的方法，所以还应对其有关物质的检测方法做研究，确保河豚毒素药品质量和用药安全。

3、河豚毒素医药开发展望

河豚毒素虽为剧毒，但是其高活性和高特异性的生物特征有着潜在的、巨大的医药开发价值，在临床应用方面有广阔的前景，如果利用妥当，“变毒为宝”，既减少河豚毒素处理不当对环境造成的污染，又可以创造经济利润。从稀有昂贵的河豚鱼卵巢、肝脏等内脏器官中提取河豚毒素，技术要求精湛，寻找到先进、合理的提取工艺，可以申请专利，形成技术壁垒，具有很高的商业开发价值。

河豚毒素的临床应用研究显示，河豚毒素可以用作消炎镇痛药物、还有局麻、治疗肌肉痉挛的功效，河豚毒素既可以治疗心血管疾病，又可以作为毒品的戒断药物。日本有河豚毒素针剂，国外其它国家尚未有以河豚毒素为主药成分的药物研究，国内已有多个厂家正在申报河豚毒素的原料药及其制剂，现已通过审评进入临床阶段，充分肯定了河豚毒素开发的可观前景。

八、TTX的应用前景，存在的问题及展望

尽管TTX 及其类似物作为防御性化学武器广泛分布于海生动物和两栖动物中,但对它们的生物合成途径还知之甚少。很多细菌可以合成TTX 及其类似物,但为什么要合成这些毒素,为什么TTX集中分布于河豚鱼的卵巢部位,目前还没有得出肯定的结论。

近年来关于TTX 及其类似物的不对称合成已经完成,但其产量低,目前TTX 的供应主要依靠于从河豚中直接提取,致使TTX 类化合物非常昂贵,这在一定程度上限制了TTX 类化合物作为工具药的广泛应用。

关于TTX 及其类似物的化学结构研究已经成熟,但关于TTX 的结构修饰和构效关系的研究还未见报道。由于TTX 类化合物的毒性太强,限制了其临床应用,将来经过结构修饰或改造降低其毒性有可能扩大其临床应用。其药理作用和临床应用已有专门综述,但新的作用机制还在不断的被发现。

‘玖’ 液质联用的发展历程

自20 世纪70 年代初，人们开始致力于液-质联用接口技术的研究。在开始的20 年中处于缓慢的发展阶段，研制出了许多种联用接口，但均没有应用于商业化生产。直到大气压离子化（atmospheric-pressure ionization, API）接口技术的问世，液-质联用才得到迅猛发展，广泛应用于实验室内分析和应用领域。
液-质联用接口技术主要是沿着三个分支发展的：
（1）流动相进入质谱直接离子化，形成了连续流动快原子轰击（continuous-flow fast atom bombarment, CFFAB）技术等；
（2）流动相雾化后除去溶剂，分析物蒸发后再离子化，形成了“传送带式”接口（moving-belt interface）和离子束接口（particle-beam interface）等；
（3）流动相雾化后形成的小液滴解溶剂化，气相离子化或者离子蒸发后再离子化，形成了热喷雾接口（thermo spray interface）、大气压化学离子化（atmospheric pressure chemical ionization, APCI）和电喷雾离子化（electrospray ionization, ESI）技术等。有关液相质谱的接口技术和LC-MS 技术的发展，Niessen 曾经进行了较为详细的综述。
1 液体直接导入接口
1972 年，Tal’roze 等人提出了直接将色谱柱出口导入质谱的思想，当时称之为毛细管入口界面。相继有许多研究组开展这方面的研究，在1980 年这种液质接口已经用于商业化生产。为了避免非挥发溶剂的污染，Melera 使用一个小的横隔膜对这一接口进行了改进，研制成了液体直接导入接口（direct liquid introction interface）技术。该接口是将液相色谱的流动相沿着进样杆流动，然后通过一个直径为3-5µm 的针孔，使液体射入质谱计的CI 离子源中。采用传统的CI 离子源可以很容易地把色谱与质谱计相连或脱开。
液体直接导入接口的优点是：接口简单，造价低廉，可将非挥发性和热不稳定性的化合物温和地转化成气态，样品以溶液状态进入质谱形成了CI 条件，可得到分子量信息。缺点是：分流过程中需要减少大量的流动相，使用的隔膜经常堵塞。
2 连续流动快原子轰击
1985 和1986 年，快原子轰击（FAB）和连续流动快原子轰击（CFFAB）接口技术相继问世，并随后投入了商业化生产。快原子轰击是用加速的中性原子（快原子）撞击以甘油调和后涂在金属表面的有机物（“靶面”），导致这些有机化合物的电离。分析物经中性原子的撞击获取足够的动能以离子或中性分子的形式由靶面逸出，进入气相，产生的离子一般是准分子离子。在此基础上发展的连续流动快原子轰击技术，得到更广泛的应用。其甘油的浓度在2%-5%之间，比静态的FAB使用的甘油量少，且测定过程中“靶面”得到不断更新，其化学物理性质变化很小，同时经色谱分离后的共存物质不会同时出现在“靶面”上，因此大大降低了噪声，信噪比提高，定量分析的重现性也得到改善。
连续流动快原子轰击接口的优点：是一种“软”离子化技术，适用于分析热不稳定、难以汽化的化合物，尤其是对肽类和蛋白质的分析在当时是最有效的。缺点是：只能在较低的流量下工作，一般小于5µl/min，大大限制了液相柱的分离效果，流动相中使用的甘油会使离子源很快变脏，同时容易堵塞毛细管，混合物样品中共存物质的干扰也会抑制分析物的离子化，降低灵敏度。
3 “传送带式”接口
1977 年，世界上第一台商业化生产的液-质联用接口就是使用传送带式（moving-belt, MB）技术，是由Mac Fadden 等人对前人研制的传送线式接口技术的改进。该接口是液相的流动相不停地由传送带送入质谱离子源，传送带可根据流动相的组成进行调整。在传送过程中，样品闪蒸解离进入离子源，在进入离子源前通过两个不同的泵和真空阀在减压条件下加热除去流动相，可以连接EI、CI 或FAB。在分析未知化合物时，可连接EI 分析，获得的谱图可以在质谱数据库检索。分析大分子生物样品时，多选用FAB。在CI 条件下，当样品与CI等离子体完全接触的状态下才可获得最佳结果。
传送带式接口的优点是：对挥发性溶剂的传送能力高达1.5ml/min，对纯水会减少至0.5ml/min；喷射装置与传送带表面呈45o 夹角时，可以改善色谱积分曲线；非挥发性缓冲液可以从传送带上除去，可以使用非挥发性缓冲溶液；对样品的收集率和富集率都较高。缺点是：传送带的记忆效应不易消除，检测信号的背景值较高，只能分析热稳定性的化合物。
4 离子束接口
离子束接口（ particle-beam interface,PB ） 是从单分散气溶胶界面（monodisperse aerosol generating interface for chromatography, MAGIC）发展来的。该接口将液相色谱的流动相在常压下借助气动雾化产生气溶胶，气溶胶扩展进入加热的去溶剂室，此时待测分子通过一个动量分离器与溶剂分离，然后经一根加热的传送管进入质谱。分析物粒子在离子源与热源室的内壁碰撞而分解，溶剂蒸发后释放出气态待测分子即可进行离子化。
离子束接口的优点是：分析范围比热喷雾接口更宽，将电离过程与溶剂分离过程分开，更适合于使用不同的流动相，不同的分析物质；主要用于分析非极性或中等极性，分子量小于1,000 的化合物，在药残、药物代谢分析、化工方面曾有许多成功的实例分析。其缺点是：灵敏度变化范围大，线性响应的浓度范围较窄，两种化合物的协同洗脱会对响应产生不可预测的效应，使用高速氦气造价太高，离子化手段仍然是电子轰击，不适于分析热不稳定的化合物。
5热喷雾接口
热喷雾接口（thermo spray interface）是从20 世纪70 年代中期开始在美国休斯顿大学实验室立项研究，旨在解决在液相和质谱之间传送1ml/min 流速水溶液流动相的难题，可使用EI和CI两种离子化源。在最初的设计中非常复杂，直到1987 年后的五年内才得到突飞猛进的发展。该接口是将液相色谱的流动相通过一根电阻式加热毛细管进入一个加热的离子室，毛细管内径约0.1mm，比液体直接导入接口的取样孔大很多。毛细管的温度调节到溶剂部分蒸发的程度，产生蒸汽超声喷射，在含有水溶剂的情况下，喷射中含有夹带荷电小液滴的雾状物。由于离子室是加热的，并由前级真空泵预抽真空，当液滴经过离子源时继续蒸发变小，有效地增加了荷电液滴的电场梯度。最终使其成为自由离子而从液滴表面释放出去，通过取样锥内的小孔离开热喷雾离子源。
热喷雾接口的优点是：可以减少进入质谱的溶剂量，对不挥发的分析物分子也可电离，可以接受的溶剂流量大致范围为0.5~2.5ml/min，但不允许有不挥发性缓冲溶液。缺点是：该接口技术的重现性较差，受溶剂成分、取样杆温度及离子源温度的影响；是一种软电离技术，在谱图中只有分子离子峰，碎片非常少；对分析物要求有一定的极性，流动相中要有一定量的水，对热稳定性差的化合物有明显的分解作用。
6 电喷雾离子化技术
电喷雾（ESI）技术作为质谱的一种进样方法起源于20 世纪60 年代末Dole等人的研究，直到1984 年Fenn实验组对这一技术的研究取得了突破性进展。1985 年，将电喷雾进样与大气压离子源成功连接。1987 年，Bruins 等人发展了空气压辅助电喷雾接口，解决了流量限制问题，随后第一台商业化生产的带有API 源的液-质联用仪问世。ESI 的大发展主要源自于使用电喷雾离子化蛋白质的多电荷离子在四极杆仪器上分析大分子蛋白质，大大拓宽了分析化合物的分子量范围。
ESI 源主要由五部分组成：（1）流动相导入装置；（2）真正的大气压离子化区域，通过大气压离子化产生离子；（3）离子取样孔；（4）大气压到真空的界面；（5）离子光学系统，该区域的离子随后进入质量分析器。在ESI 中，离子的形成是分析物分子在带电液滴的不断收缩过程中喷射出来的，即离子化过程是在液态下完成的。液相色谱的流动相流入离子源，在氮气流下汽化后进入强电场区域，强电场形成的库仑力使小液滴样品离子化，离子表面的液体借助于逆流加热的氮气分子进一步蒸发，使分子离子相互排斥形成微小分子离子颗粒。这些离子可能是单电荷或多电荷，取决于分子中酸性或碱性基团的体积和数量。
电喷雾离子化技术的突出特点是：可以生成高度带电的离子而不发生碎裂，可将质荷比降低到各种不同类型的质量分析器都能检测的程度，通过检测带电状态可计算离子的真实分子量，同时，解析分子离子的同位素峰也可确定带电数和分子量。另外，ESI 可以很方便地与其它分离技术联接，如液相色谱、毛细管电泳等，可方便地纯化样品用于质谱分析。因此在药残、药物代谢、蛋白质分析、分子生物学研究等诸多方面得到广泛的应用。其主要优点是：离子化效率高；离子化模式多，正负离子模式均可以分析；对蛋白质的分析分子量测定范围高达105 以上；对热不稳定化合物能够产生高丰度的分子离子峰；可与大流量的液相联机使用；通过调节离子源电压可以控制离子的断裂，给出结构信息。
7 大气压化学离子化技术
大气压化学离子化（APCI）技术应用于液-质联用仪是由Horning 等人于20 世纪70 年代初发明的，直到20 世纪80 年代末才真正得到突飞猛进的发展，与ESI 源的发展基本上是同步的。但是APCI 技术不同于传统的化学电离接口，它是借助于电晕放电启动一系列气相反应以完成离子化过程，因此也称为放电电离或等离子电离。从液相色谱流出的流动相进入一具有雾化气套管的毛细管，被氮气流雾化，通过加热管时被汽化。在加热管端进行电晕尖端放电，溶剂分子被电离，充当反应气，与样品气态分子碰撞，经过复杂的反应后生成准分子离子。然后经筛选狭缝进入质谱计。整个电离过程是在大气压条件下完成的。
APCI 的优点是：形成的是单电荷的准分子离子，不会发生ESI 过程中因形成多电荷离子而发生信号重叠、降低图谱清晰度的问题；适应高流量的梯度洗脱的流动相；采用电晕放电使流动相离子化，能大大增加离子与样品分子的碰撞频率，比化学电离的灵敏度高3 个数量级；液相色谱-大气压化学电离串联质谱成为精确、细致分析混合物结构信息的有效技术。
早在19世纪末，E.Goldstein在低压放电实验中观察到正电荷粒子，随后W.Wein发现正电荷粒子束在磁场中发生偏转，这些观察结果为质谱的诞生提供了准备。
世界上第一台质谱仪于1912年由英国物理学家Joseph John Thomson（1906年诺贝尔物理学奖获得者、英国剑桥大学教授）研制成功；到20世纪20年代，质谱逐渐成为一种分析手段，被化学家采用；从40年代开始，质谱广泛用于有机物质分析；1966年，M.S.B，Munson和F.H. Field报道了化学电离源（Chemical Ionization，CI），质谱第一次可以检测热不稳定的生物分子；到了80年代左右，随着快原子轰击（FAB）、电喷雾（ESI）和基质辅助激光解析（MALDI）等新“软电离”技术的出现，质谱能用于分析高极性、难挥发和热不稳定样品后，生物质谱飞速发展，已成为现代科学前沿的热点之一。由于具有迅速、灵敏、准确的优点，并能进行蛋白质序列分析和翻译后修饰分析，生物质谱已经无可争议地成为蛋白质组学中分析与鉴定肽和蛋白质的最重要的手段。
质谱法在一次分析中可提供丰富的结构信息，将分离技术与质谱法相结合是分离科学方法中的一项突破性进展。如用质谱法作为气相色谱（GC）的检测器已成为一项标准化GC 技术被广泛使用。由于GC-MS 不能分离不稳定和不挥发性物质，所以发展了液相色谱（LC）与质谱法的联用技术。LC-MS可以同时检测糖肽的位置并且提供结构信息。1987年首次报道了毛细管电泳（CE）与质谱的联用技术。CE-MS 在一次分析中可以同时得到迁移时间、分子量和碎片信息，因此它是LC-MS的补充。
在众多的分析测试方法中，质谱学方法被认为是一种同时具备高特异性和高灵敏度且得到了广泛应用的普适性方法。质谱的发展对基础科学研究、国防、航天以及其它工业、民用等诸多领域均有重要意义。