为什么酶促反应要严格控制时间

Ⅰ 酶促反应中为什么延长反应时间,最适温度降低

因为温度会影响酶的失活速率，有的酶在催化瞬间速率最高时迅速失活。若所需的时间短，就尽量选最高效率；要长时间反应就要尽量保持酶活性。所以要综合考虑催化效率和失活速率。

Ⅱ 测定酶活力要注意控制哪些条件

1、底物浓度：除选择适合的底物外，在实际应用中更多考虑的是底物浓度。由于［S］与反应速度V成双曲线关系，在酶活性测定时，要求［S］达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比。

2、酶浓度：在反应条件一定时，酶浓度与反应速度成正比。按照中间产物学说，只有［S］>>［E］时，酶才能被底物分子饱和，反应速度才能达到最大值。因此当标本酶活力过高时，应将标本适当稀释后再加以测定。

3、温度：不同的酶最适温度可以不同，多数酶的最适温度在37～40℃。高于或低于最适温度，酶活性都降低。

4、离子强度和pH值：在最适pH时，酶的活性最强，高于或低于最适pH，酶的活性都降低。

一般采用电化学和光物理的方法

即利用反应物或产物的吸光性，用紫外分光光度法或荧光法测定。若酶反应过程中产物或反应物有气体，则可用测压仪(瓦氏呼吸仪)测定。若反应过程中生成酸，则可用电化学法。用同位素标记的底物则可用放射化学法测定底物浓度变化，计算酶活性。一些性质稳定的酶，也可用高效液相色谱法检测。

以上内容参考：网络-酶活性测定

Ⅲ 双倒数法测定米氏常数的实验中,决定试验成败的因素，关键因素又是什么！

1）实验应在初速度时间范围内进行；2)配置不同浓度的底物溶液浓度时应该用同一母液进行稀释，以保证底物浓度的准确性；3）各种试剂的加入时间，加入量应非常精确；4）要严格控制酶促反应时间做到准确无误；5）要将酶液稀释到恰当的浓度；6）作图要准确。

Ⅳ 酶促反应的最适温度为什么和反应时间有关

因为温度会影响酶的失活速率，有的酶在催化瞬间速率最高时迅速失活。若所需的时间短，就尽量选最高效率；要长时间反应就要尽量保持酶活性。所以要综合考虑催化效率和失活速率。

Ⅳ 在PH值相同的情况下,酶促反应所需时间主要与哪些因素有关

ph值对酶反应活力的影响
1、
酸或碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶的活力丧失，这种丧失活力可以是可逆的或者是不可逆的，对可逆的来说，改变ph值后可使活力恢复。
2、
酸或碱影响酶的活性部位催化基团的离解状态，使得底物不能分解成产物。
3、
酸或碱影响酶的活性部位结合基团的离解状态，使得底物不能和它结合。
4、
酸或碱影响底物的离解状态，或使底物不能和酶结合。
由于上述种种原因，各种酶的作用都有一个最适合的ph值范围。
用酶活力对ph值作图，往往是钟罩形曲线。最适合的ph值还随着底物浓度、温度和其他条件的变化而变化，因此确定最适合的ph值应在所实验的条件下测得。
需要指出的是：
酶的最适ph不是一个特征性常数不同种类的酶，其最适合的ph值范围不同；
同一种酶，来源不同，其最适合的ph值也有差异；
同一种酶由于作用底物不同，酶最适合的ph值也不同；
同一种酶作用于同一底物，随着温度等条件变化，最适合的ph值也有变化
如唾液淀粉酶最适ph为6.8，但在磷酸缓冲溶液中，其最适ph为6.4—6.6，而在乙酸缓冲溶液中则为5.6。总之，不同的酶在不同的ph值范围不仅稳定性不同，而且活力也不同，在最适合的ph值内活力最强，这是酶的一个重要特征，要仔细控制。
下面是具体的实验步骤在连接里~

Ⅵ 温度稍高使酶活性下降，为什么能恢复

酶是生物催化剂,升高温度在提高反应速度的同时也增加酶变性失活的机会.
一般来说,温度升高到60℃以上时,大多数酶开始变性,80℃时,多数酶的变性已经不可逆转。
综合这两方面因素,酶促反应速度最大时的环境温度称为酶促反应的最适温度。
酶的最适温度不是酶的特征性常数,它与酶促反应时间有密切关系：酶可以在较短的时间内耐受较高的温度；相反,延长反应时间,酶的最适温度则下降.另外,虽然酶在低温下的活性降低,但一般不引起酶的变性,温度上升后,酶又可以恢复活性,因此生化实验测定酶活性时,应严格控制反应液的温度。

Ⅶ 酶活力测定中为什么各样品与底物测定的时间要严格一致

酶活力测定中各样品与底物测定的时间要严格一致，是为了保证在酶的稳定反应状况之下获取可比数据。

酶活力常用其催化某一化学反应的能力来表示。通过作出反应曲线可以用线上任何一点的斜率去表征该时间上的反应速率。在这些酶促反应中，只有初始阶段产物生成量与反应时间呈线性关系。换言之，酶促反应初始速度是不变的。随着时间的延长，斜率逐渐降低曲线上升趋缓，反应速度降低，此时测得的不是真实的酶活力。

另一方面，随着反应时间推移，反应物浓度降低产物浓度增加，它加速了逆反应的进程，并产生对酶的抑制。故测定酶活力应该测定酶促反应的初速率，在其线性范围里进行测定。

所以，在酶活力测定中各样品与底物测定的时间要控制严格一致，使之均处于线性范围和稳定的初速度之中，以保持两组数据之间稳定的相关性和可比性。

Ⅷ 生化试验 测定酶活力时需要对试剂、作用时间等严格控制

淀粉酶活力的测定
一、目的

学习和掌握测定淀粉酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）活力的原理和方法。

二、原理

淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：

淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。

淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1．实验材料

萌发的小麦种子（芽长约1cm）

2．仪器

（1）离心机

（2）离心管

（3）研钵

（4）电炉

（5）容量瓶：50mL×1, 100mL×1

（6）恒温水浴

（7）20mL具塞刻度试管×13

（8）试管架

（9）刻度吸管：2mL×3, 1mL×2, 10mL×1

（10）分光光度计

3．试剂（均为分析纯）

（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。

（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。

（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液

A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7·H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。

B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7·2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。

取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。

（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。

四、操作步骤

1．麦芽糖标准曲线的制作

取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：

表1 麦芽糖标准曲线制作

试 剂
管 号

1
2
3
4
5
6
7

麦芽糖标准液（mL）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0

蒸馏水（mL）
2.0
1.8
1.4
1.0
0.6
0.2
0

麦芽糖含量（mg）
0
0.2
0.6
1.0
1.4
1.8
2.0

3,5-二硝基水杨酸（mL）
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0

摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。

2．淀粉酶液的制备

称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3 000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定。

吸取上述淀粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。

2． 酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。

表2 酶活力测定取样表

操 作 项 目 α‑淀粉酶活力测定 β-淀粉酶活力测定

Ⅰ- 1 Ⅰ- 2 Ⅰ- 3 Ⅱ- 4 Ⅱ- 5 Ⅱ- 6

淀粉酶原液（mL） 1.0 1.0 1.0 0 0 0

钝化β-淀粉酶 置70℃水浴15min，冷却

淀粉酶稀释液（mL） 0 0 0 1.0 1.0 1.0

3,5-二硝基水杨酸（mL） 2.0 0 0 2.0 0. 0

预保温 将各试管和淀粉溶液置于40℃恒温水浴中保温10min

1%淀粉溶液（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

保温 在40℃恒温水浴中准确保温5min

3,5-二硝基水杨酸（mL） 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0

将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线。

五、结果计算

计算Ⅰ- 2、Ⅰ- 3光密度平均值与Ⅰ- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下列公式计算α- 淀粉酶的活力。

计算Ⅱ- 2、Ⅱ- 3光密度平均值与Ⅱ- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下式计算（α＋β）淀粉酶总活力。

β-淀粉酶活力＝（α＋β）淀粉酶总活力－α-淀粉酶活力

六、附 注

（1）样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。

（2）为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过±0.5℃。

（3）如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。

推荐网址：
http://www.estarch.com/news/26/news_6498.html
http://www.bbioo.com/bio101/2006/7201.htm
http://www.scuta.e.cn/yuanxi/bylw/syzd/srdsyzdsy18.htm

Ⅸ 细菌内毒素不同实验条件对结果的影响

细菌内毒素检查是一复杂的酶促反应过程，检查条件的任何变化都会对实验结果产生影响。中国药典附录”细菌内毒素检验法“项下明确规定：
1、反应温度37℃±1℃，时间60min±2min。反应时间与温度一定要严格控制好，否则会得出错误结论。如果反应温度或反应时间不足都会-----出现假阳性；同时反应温度或反应时间超出药典规定会-----出现假阴性。
2、药典规定该试验应在1万级环境内的100级区域下进行。然而对试验室温度要求在检查项下未做明确规定，但从中国药典凡例三十条4项下：除另有规定外应以25℃±2℃为准。
我本人认为试验环境没有必要控制在1万级环境内局部100级区域下进行，因这种环境反而易污染内毒素（原因：以前试验时污染的内毒素溶液挥发后易从风口吹出）。但实验室温度最好控制在20℃以下，这是一个酶促反应，温度对其影响比较大。
3、供试品溶液的pH值、离子浓度、鲎试剂的灵敏度及操作人员的操作水平等因素都会影响到试验结果。
因此，中国药典2015年版开始对“细菌内毒素检查”做了较大修改：
① 做“鲎试剂灵敏度复核”试验。该试验的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定的一次考核；
② “干扰试验”，当一个新的药品制订“质量标准”时或生产企业的原料来源、配方和生产工艺发生变化时都应做“干扰试验”；消除干扰的方法一般采用BET水稀释或加酸碱调节pH的方法消除干扰。其目的是确证供试品在该试验浓度及试验条件下对鲎试剂与细菌内毒素的反应无干扰作用。
③ 平时做“细菌内毒素检查”试验时，分别做：供试品2管；PPC2管；阳性对照2管；阴性对照2管。并且规定当阳性对照管、PPC管都为阳性且阴性对照管都为阴性时实验才可认为有效。否则，实验结果无效。
原因：如果阳性对照管不是阳性，=====出现该问题的原因最大可能性是出在“细菌内毒素标准溶液的制备”第一步，内毒素标准品或工作标准品加BET水复溶是很关键的一步，一定要按药典操作，既加BET水后在振荡器上振荡，15min，否则内毒素混合不均匀会出现这种清况；其次是更换不同批号或不同厂家的鲎试剂或BET水后，一定要做鲎试剂灵敏度复核试验，否则不知该批鲎试剂灵敏度及检查用水是否符合要求。-
--------阴性对照管不是阴性说明BET水有污染。
---------PPC管应显阳性，而未显阳性说明供试品或供试品稀释液在该试验条件下对试验有干扰。
如对细菌内毒素检查法感兴趣，你可以用“网络”搜索下近年来我在《中国药师》、《中国药业》、〈海峡药学〉等专业杂志上发表的有关细菌内毒素检查内容的文章，“得力生注射液细菌内毒素检查法的探讨”、“吡拉西坦细菌内毒素检查方法的建立”、“长春西汀葡萄糖注射液细菌内毒素检查法的研究”、“地塞米松磷酸钠原料药细菌内毒素检查法的建立”、“利巴韦林细菌内毒素检查法的建立”、“维生素C注射液细菌内毒素检查中干扰问题的探讨”等论文，以加深对该问题的理解。

Ⅹ 酶促反应中：酶促反应的速度、底物浓度、酶浓度、反应时间的关系

酶促反应速度V
,底物浓度S
,酶浓度E
,反应时间T,
产物浓度P
,米氏常数Km
研究酶促反应是为了测定酶活力，而所说的酶促反应速度是指初速度。
酶促反应速率曲线图（P-T）表明，在最初T内，P与T呈直线关系，即V保持不变，随着T延长，V下降。原因是：逆反应加速，PH的改变影响酶活力，产物对酶的抑制等。要排除上述干扰，测酶活时只能用直线部分，即初速度。
在任何S下，V都与E成正比
初V与T无关
当S<<Km时，V与S成正比
当S>>Km时，V=Vmax