为什么不同软件设计的引物不一样

⑴ 为什么我用primer设计的引物评分都这么低

引物设计和序列关系比较大，有些序列容易设计引物，有些序列很难设计引物评分低的引物也可以试试。不同软件之间也是有差异的
用primer6设计的引物，评分在100，用beacon design评价引物的时候，评分可能只有80

⑵ 同一个基因，PubMed上不同文献有不同的引物设计

回答同1L

LZ可以像1L说的看看是不是同一物种的同一基因，是的话那就随便那对都能用，之所以会不一样可能是由于扩增产物的长度不一样而引起的。

同一个基因用Primer设计的话也是可以设计出好几对引物的，LZ就像1L说的那样看看是不是同一物种的同一基因，是的话就随便拿一对用就OK了。

至于那个软件很容易学到，找个会用的人当面教下你就行了，保证10分钟内你就会用了

⑶ 各种引物探针设计软件计算出来的Tm值该怎么考虑相差太大。如primer 5、primer express、oligo等。

正常primer5设计引物时，Tm在40~70之间都没有问题，基本在PCR时候按照引物合成公司给的TM值进行试验，都没有问题！除非你的引物设计的有问题。

⑷ 引物设计的、软件有哪些有什么优点和缺点

引物设计相关软件！
NoePrimer 2.03 独特的引物设计软件
Primer Premier 6.0 DEMO 序列分析与引物设计，非常棒的一个软件。
Oligo 7.36 Demo 引物设计分析着名软件，主要应用于核酸序列引物分析设计软件。
Primer D'Signer 1.1 免费的引物设计辅助软件，专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体，简化引物设计工作。
Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列（microarray）软件，批量设计DNA和寡核苷酸引物工具。
Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计软件。
NetPrimer JAVA语言写成的免费引物设计软件，用IE打开运行。
TGGE-STAR DOS软件，PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件。
e-PCR 2.3.9 电子克隆是一种电脑软件，用来识别DNA序列标签位点（STSs)。
FastPCR 6.0.165b2 快速设计各种类型PCR引物，还包括一些常用的DNA与蛋白序列软件工具；
OligoMaster 1.0.164 多用户寡核苷酸管理软件，可建立寡核苷酸数据库
PerlPrimer v1.1.19 一个免费的用来设计引物的开源软件。
AmplifX 1.5.4 设计与管理引物的软件。
AutoDimer 1.0 快速筛选二聚体引物软件。
MutaPrimer 1.00 用于定点突变的引物设计桌面工具软件
ORFprimer 1.6.4.1 JAVA语言设计的引物设计软件
Primer Prim'er 5.6.0 Flash制作的PCR引物设计软件。
PCR Analyzer 1.0 实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件
在线工具
DNAWorks 3.0 是一个帮助进行基因合成的设计寡核苷酸序列的免费程序。 程序仅需要输入一些简单的信息，比如，目标蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的温度。程序输出的为适合所选择生物表达的优化密码子的核酸序列。利用DNAWorks的帮助，用两步PCR法，可以成功合成长度达到3000碱基对的基因。原始网站。
The Primer Generator 在线引物设计程序。
Primer 3 比较有名的在线引物设计程序。
Primo Pro 3.4 在线PCR引物设计java系列软件。
Web Primer 斯坦福大学提供的在线引物设计软件。
AutoPrime 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件 .

一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。

附上两款软件使用方法！
Primer Premier 5.0 的使用技巧简介
1. 功能
“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计( )、限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源性分析功能（ ），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、语音提示键盘输入（ ）等等。
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。
2. 使用步骤及技巧
“Premier”软件启动界面如下：
(转载的时候就没有图)
其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。
进行引物设计时，点击按钮，界面如下：
进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交****（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然
后按，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时，再按，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标（如下图）。
点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”主窗口，如图所示：
该图分三部分，最上面是图示PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。
在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易 使用，是一个相当不错的软件。

Oligo 6.22 使用技巧简介
1. 功能
在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最着名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo 6.22 的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
2. 使用（以Oligo 6.22 为例）
Oligo 6.22 的启动界面如下：
图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo5.0，只是显示更清楚了。
经过Windows/Tili 项后的显示如图：
在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm 图块上左下角的Upper 按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。∆G 值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：）
Tm 值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq 值相对较低的片段。
当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5 为好。
当然，在设计克隆目的的PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测。这项检查
可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键弹出PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。
由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。
除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由Whitehead Institute开发的“Primer 3”等（本网站http://210.72.11.60/ 已引进并调试好该软件，欢迎使用）。该软件的独特之处在于，对全基因组PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用。

⑸ RT-PCR用的引物与以DNA为模板的普通PCR一样吗

不一样，RT-PCR扩增的片段较短。
普通pcr是为了扩增某一片断，引物设计时会倾向于要扩增的目的片段。而RT-PCR主要是为了检测，引物设计侧重于检测片段的特异性和引物的有效扩增。
所以，这两个pcr的引物设计软件也是不同的。

⑹ 再设计引物时,为什么CDS一样,结果设计出不同的引物对应的产物长度相差悬殊

唉 你都说了是不同的引物 那扩增的区域肯定不一样啊 所谓的CDS一样 只是你都是包含了这段CDS 至于前后别的序列肯定不同引物包含的区域不同嘛

⑺ 为什么做pcr和测序用的引物不一样

pcr引物和测序引物是可以通用的，最多是纯化方式不一样，测序的要求高一些。
最重要的是，pcr扩增是从引物开始的，而测序一般要从引物下游几十个bp以后，信号才逐渐稳定，能够读出来。所以拿pcr引物去测序，那只能测出引物下游几十个bp以后的片段，这样你pcr的片段就会测不全。故而需要重新设计测序引物，一般要在所测片段的上游一些。

⑻ 用软件设计引物的时候，给出的结果位置不相同

在基因的ORF上游延伸一些序列(包括的3'或者5‘URT)在设计引物！！！，不仅仅是你的ORF序列，只要里面有ORF就行了

⑼ 引物设计的问题（粘贴转抄者勿进）

不用手动输进去的，你将那些信息复制下来，用写字板保存，然后用软件DNAstar的时候可以导入进去的，设计引物的时候当然要全部信息弄进去啊，除非你知道那一段有特殊的化学或者物理功能，可以就输那一段进去。
可以生成的引物有很多，但不排除很少的情况啊，还有没种引物的TM一般不一样的，你选择的时候要看你是用引物的环境，像高温啊，酸性啊，等等都是你考虑的因素。
还有怎么选择才是你研究的对象了，你可以选择那些符合试验条件的，然后剔除一些很少用到的，最后一般剩下几种，然后一一试试，看看那个结果好一点啊，这就是最佳引物了。。。。
引物多种多样，结构也可能出现你的状况，其实用软件农出来的引物还是要你自己去检验是不是引物啊，计算机设计不一定就可以，计算机只不过是提供一个指导的作用，所以，不管引物长得怎么样，尽管去试试就知道了，不行的话就换其他种。
今天我去问了老师了，这个是正常现象，但是具体的解释就不是很清楚，因为我们不知道你究竟怎么弄的，还有这个PRIMER要比那个DNAstar的好很多。

⑽ 关于使用primer 5.0设计PCR引物，哪位哥帮帮我啊，着急啊...

首先设计引物以前的清楚设计引物基本原则例如测序使用引物：测序用引物要求非常严格，不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板结合，3’ 端的几个碱基能完全配对，即使引物长达80~100多个碱基，只要调整PCR反应条件，也能成功进行PCR反应。
而测序用引物便不一样了，必须严格符合以下要求。无论你使用primer 5.0或者oligo 6.0设计.
●长度在18~25个碱基左右，一般选择20个碱基（根据GC含量作 适当调整)，3’ 端尽量选择G或C碱基 （但不绝对），以增加与模板的结合能力。
●Tm温度应选择50℃~70℃左右。
●GC含量应选择在50%左右，尽量避开A、T、G、C的连续结构。
●避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结构。
●保证引物和模板100%匹配，特别是3’端的几个碱基一定要100%匹配。同时必须严格保证引物和模板之间只能有一个结合位点。
这些在使用软件时已经进行默认无需修改。软件安装时已经进行调整.一般遵循以上原则没有太大问题.在显示的搜索结果中没有合适的可以在序列上选取符合设计引物条件的引物.
其次，软件找出的引物可以进行修改但是不是修改引物序列中的某个碱基.而是对选出的引物去前或者后末端寻找适合条件引物.最好是你现选出的引物至少符合错配或者发夹其中一项要求.
以上为测序使用引物设计.如你存在疑问或者需要帮忙设计请发你的序列说明要求互相探讨一下.