為什麼不同軟體設計的引物不一樣

⑴ 為什麼我用primer設計的引物評分都這么低

引物設計和序列關系比較大，有些序列容易設計引物，有些序列很難設計引物評分低的引物也可以試試。不同軟體之間也是有差異的
用primer6設計的引物，評分在100，用beacon design評價引物的時候，評分可能只有80

⑵ 同一個基因，PubMed上不同文獻有不同的引物設計

回答同1L

LZ可以像1L說的看看是不是同一物種的同一基因，是的話那就隨便那對都能用，之所以會不一樣可能是由於擴增產物的長度不一樣而引起的。

同一個基因用Primer設計的話也是可以設計出好幾對引物的，LZ就像1L說的那樣看看是不是同一物種的同一基因，是的話就隨便拿一對用就OK了。

至於那個軟體很容易學到，找個會用的人當面教下你就行了，保證10分鍾內你就會用了

⑶ 各種引物探針設計軟體計算出來的Tm值該怎麼考慮相差太大。如primer 5、primer express、oligo等。

正常primer5設計引物時，Tm在40~70之間都沒有問題，基本在PCR時候按照引物合成公司給的TM值進行試驗，都沒有問題！除非你的引物設計的有問題。

⑷ 引物設計的、軟體有哪些有什麼優點和缺點

引物設計相關軟體！
NoePrimer 2.03 獨特的引物設計軟體
Primer Premier 6.0 DEMO 序列分析與引物設計，非常棒的一個軟體。
Oligo 7.36 Demo 引物設計分析著名軟體，主要應用於核酸序列引物分析設計軟體。
Primer D'Signer 1.1 免費的引物設計輔助軟體，專門用於pASK-IBA和pPR-IBA表達載體，簡化引物設計工作。
Array Designer 4.25 Demo DNA微陣列（microarray）軟體，批量設計DNA和寡核苷酸引物工具。
Beacon Designer 7.80 Demo 實時熒光定量PCR分子信標(Molecular beacon )及TaqMan探針設計軟體。
NetPrimer JAVA語言寫成的免費引物設計軟體，用IE打開運行。
TGGE-STAR DOS軟體，PCR結合梯度凝膠電泳實驗引物設計軟體。
e-PCR 2.3.9 電子克隆是一種電腦軟體，用來識別DNA序列標簽位點（STSs)。
FastPCR 6.0.165b2 快速設計各種類型PCR引物，還包括一些常用的DNA與蛋白序列軟體工具；
OligoMaster 1.0.164 多用戶寡核苷酸管理軟體，可建立寡核苷酸資料庫
PerlPrimer v1.1.19 一個免費的用來設計引物的開源軟體。
AmplifX 1.5.4 設計與管理引物的軟體。
AutoDimer 1.0 快速篩選二聚體引物軟體。
MutaPrimer 1.00 用於定點突變的引物設計桌面工具軟體
ORFprimer 1.6.4.1 JAVA語言設計的引物設計軟體
Primer Prim'er 5.6.0 Flash製作的PCR引物設計軟體。
PCR Analyzer 1.0 實時RT-PCR反應中估算初始擴增子濃度軟體
在線工具
DNAWorks 3.0 是一個幫助進行基因合成的設計寡核苷酸序列的免費程序。 程序僅需要輸入一些簡單的信息，比如，目標蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的溫度。程序輸出的為適合所選擇生物表達的優化密碼子的核酸序列。利用DNAWorks的幫助，用兩步PCR法，可以成功合成長度達到3000鹼基對的基因。原始網站。
The Primer Generator 在線引物設計程序。
Primer 3 比較有名的在線引物設計程序。
Primo Pro 3.4 在線PCR引物設計java系列軟體。
Web Primer 斯坦福大學提供的在線引物設計軟體。
AutoPrime 快速設計真核表達實時定量PCR引物在線軟體 .

一般性引物自動搜索可採用「Premier Primer 5」軟體，而引物的評價分析則可採用「Oligo 6」軟體。

附上兩款軟體使用方法！
Primer Premier 5.0 的使用技巧簡介
1. 功能
「Premier」的主要功能分四大塊，其中有三種功能比較常用，即引物設計( )、限制性內切酶位點分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。「Premier」還具有同源性分析功能（ ），但並非其特長，在此略過。此外，該軟體還有一些特殊功能，其中最重要的是設計簡並引物，另外還有序列「朗讀」、DNA 與蛋白序列的互換（ ）、語音提示鍵盤輸入（ ）等等。
有時需要根據一段氨基酸序列反推到DNA 來設計引物，由於大多數氨基酸（20 種常見結構氨基酸中的18 種）的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列時，會遇到部分鹼基的不確定性。這樣設計並合成的引物實際上是多個序列的混和物，它們的序列組成大部分相同，但在某些位點有所變化，稱之為簡並引物。遺傳密碼規則因物種或細胞亞結構的不同而異，比如在線粒體內的遺傳密碼與細胞核是不一樣的。「Premier」可以針對模板DNA 的來源以相應的遺傳密碼規則轉換DNA 和氨基酸序列。軟體共給出八種生物亞結構的不同遺傳密碼規則供用戶選擇，有纖毛蟲大核（Ciliate Macronuclear）、無脊椎動物線粒體（Invertebrate Mitochondrion）、支原體（Mycoplasma）、植物線粒體（Plant Mitochondrion）、原生動物線粒體（Protozoan Mitochondrion）、一般標准（Standard）、脊椎動物線粒體（Vertebrate Mitochondrion）和酵母線粒體（Yeast Mitochondrion）。
2. 使用步驟及技巧
「Premier」軟體啟動界面如下：
(轉載的時候就沒有圖)
其主要功能在主界面上一目瞭然（按鈕功能如上述）。限制性酶切點分析及基元查找功能比較簡單，點擊該功能按鈕後，選擇相應的限制性內切酶或基元（如-10 序列，-35 序列等），按確定即可。常見的限制性內切酶和基元一般都可以找到。你還可以編輯或者添加新限制性內切酶或基元。
進行引物設計時，點擊按鈕，界面如下：
進一步點擊按鈕，出現「search criteria」窗口，有多種參數可以調整。搜索目的（Seach For）有三種選項，PCR 引物（PCR Primers），測序引物（Sequencing Primers），雜交****（Hybridization Probes）。搜索類型(Search Type)可選擇分別或同時查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成對查找（Pairs），或者分別以適合上、下游引物為主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外還可改變選擇區域（Search Ranges），引物長度（Primer Length），選擇方式（Search Mode），參數選擇（Search Parameters）等等。使用者可根據自己的需要設定各項參數。如果沒有特殊要求，建議使用默認設置。然
後按，隨之出現的Search Progress 窗口中顯示Search Completed 時，再按，這時搜索結果以表格的形式出現，有三種顯示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成對顯示(Pairs)。默認顯示為成對方式，並按優劣次序（Rating）排列，滿分為100，即各指標基本都能達標（如下圖）。
點擊其中一對引物，如第1#引物，並把上述窗口挪開或退出，顯示「Peimer Premier」主窗口，如圖所示：
該圖分三部分，最上面是圖示PCR 模板及產物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質，最下面是四種重要指標的分析，包括發夾結構（Hairpin），二聚體（Dimer），錯誤引發情況（False Priming），及上下游引物之間二聚體形成情況（Cross Dimer）。當所分析的引物有這四種結構的形成可能時，按鈕由變成，點擊該按鈕，在左下角的窗口中就會出現該結構的形成情況。一對理想的引物應當不存在任何一種上述結構，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有，只有。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的最佳退火溫度，可參考應用。
在需要對引物進行修飾編輯時，如在5』端加入酶切位點，可點擊，然後修改引物序列。若要回到搜索結果中，則點擊按鈕。如果要設計簡並引物，只需根據源氨基酸序列的物種來源選擇前述的八種遺傳密碼規則，反推至DNA 序列即可。對簡並引物的分析不需像一般引物那樣嚴格。總之，「Premier」有優秀的引物自動搜索功能，同時可進行部分指標的分析，而且容易 使用，是一個相當不錯的軟體。

Oligo 6.22 使用技巧簡介
1. 功能
在專門的引物設計軟體中，「Oligo」是最著名的。它的使用並不十分復雜，但初學者容易被其復雜的圖表嚇倒。Oligo 5.0 的初始界面是兩個圖：Tm 圖和ΔG 圖；Oligo 6.22 的界面更復雜，出現三個圖，加了個Frq 圖。「Oligo」的功能比「Premier」還要單一，就是引物設計。但它的引物分析功能如此強大以至於能風靡全世界。
2. 使用（以Oligo 6.22 為例）
Oligo 6.22 的啟動界面如下：
圖中顯示的三個指標分別為Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，為鄰近6至7 個鹼基組成的亞單位在一個指定資料庫文件中的出現頻率。該頻率高則可增加錯誤引發的可能性。因為分析要涉及多個指標，起動窗口的cascade 排列方式不太方便，可從windows菜單改為tili 方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個指標，如Frq，這樣界面的結構同於Oligo5.0，只是顯示更清楚了。
經過Windows/Tili 項後的顯示如圖：
在設計時，可依據圖上三種指標的信息選取序列，如果覺得合適，可點擊Tm 圖塊上左下角的Upper 按鈕，選好上游引物，此時該按鈕變成，表示上游引物已選取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower。∆G 值反映了序列與模板的結合強度，最好引物的∆G 值在5』端和中間值比較高，而在3』端相對低（如圖：）
Tm 值曲線以選取72℃附近為佳，5』到3』的下降形狀也有利於引物引發聚合反應。Frq 曲線為「Oligo 6」新引進的一個指標，揭示了序列片段存在的重復機率大小。選取引物時，宜選用3』端Frq 值相對較低的片段。
當上下游引物全選好以後，需要對引物進行評價並根據評價對引物進行修改。首先檢查引物二聚體尤其是3』端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（cross dimer）。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測（非克隆）性PCR，對引物位置、產物大小要求較低，因而應盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項檢查是發夾結構（hairpin）；與二聚體相同，發夾結構的能值越低越好。一般來說，這兩項結構的能值以不超過4.5 為好。
當然，在設計克隆目的的PCR 引物時，引物兩端一般都添加酶切位點，必然存在發夾結構，而且能值不會太低。這種PCR 需要通過靈活調控退火溫度以達到最好效果，對引物的發夾結構的檢測就不應要求太高。第三項檢查為GC 含量，以45-55％為宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導致引物的GC 含量不能被控制在上述范圍內，這時應盡量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利於退火溫度的選擇。如果PCR 的模板不是基因組DNA，而是一個特定模板序列，那麼最好還進行False priming site 的檢測。這項檢查
可以看出引物在非目的位點引發PCR 反應的可能性。如果引物在錯配位點的引發效率比較高，就可能出假陽性的PCR 結果。一般在錯配引發效率以不超過100 為好，但對於特定的模板序列，還應結合比較其在正確位點的引發效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發效率為450 以上，而在錯誤位點的引發效率為130，那麼這對引物也是可以接受的。當我們結束以上四項檢測，按Alt+P 鍵彈出PCR 窗口，其中總結性地顯示該引物的位置、產物大小、Tm 值等參數，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡單的評價。
由於「Oligo」軟體的引物自動搜索功能與「Primer Premier 5」的相類似，並且似乎並不比後者更好用，在此不再贅述。其實，使用軟體自動搜索引物就是讓計算機按照人的要求去尋找最佳引物，如果參數設置得當將大大提高工作效率。
除了本地引物設計軟體之外，現在還有一些網上引物設計軟體，如由Whitehead Institute開發的「Primer 3」等（本網站http://210.72.11.60/ 已引進並調試好該軟體，歡迎使用）。該軟體的獨特之處在於，對全基因組PCR 的引物設計；可以將設計好的引物對後台核酸資料庫進行比對，發現並排除可引發錯配的引物。因此建議經常做全基因組PCR 的用戶試用。

⑸ RT-PCR用的引物與以DNA為模板的普通PCR一樣嗎

不一樣，RT-PCR擴增的片段較短。
普通pcr是為了擴增某一片斷，引物設計時會傾向於要擴增的目的片段。而RT-PCR主要是為了檢測，引物設計側重於檢測片段的特異性和引物的有效擴增。
所以，這兩個pcr的引物設計軟體也是不同的。

⑹ 再設計引物時,為什麼CDS一樣,結果設計出不同的引物對應的產物長度相差懸殊

唉 你都說了是不同的引物 那擴增的區域肯定不一樣啊 所謂的CDS一樣 只是你都是包含了這段CDS 至於前後別的序列肯定不同引物包含的區域不同嘛

⑺ 為什麼做pcr和測序用的引物不一樣

pcr引物和測序引物是可以通用的，最多是純化方式不一樣，測序的要求高一些。
最重要的是，pcr擴增是從引物開始的，而測序一般要從引物下游幾十個bp以後，信號才逐漸穩定，能夠讀出來。所以拿pcr引物去測序，那隻能測出引物下游幾十個bp以後的片段，這樣你pcr的片段就會測不全。故而需要重新設計測序引物，一般要在所測片段的上游一些。

⑻ 用軟體設計引物的時候，給出的結果位置不相同

在基因的ORF上游延伸一些序列(包括的3'或者5『URT)在設計引物！！！，不僅僅是你的ORF序列，只要裡面有ORF就行了

⑼ 引物設計的問題（粘貼轉抄者勿進）

不用手動輸進去的，你將那些信息復制下來，用寫字板保存，然後用軟體DNAstar的時候可以導入進去的，設計引物的時候當然要全部信息弄進去啊，除非你知道那一段有特殊的化學或者物理功能，可以就輸那一段進去。
可以生成的引物有很多，但不排除很少的情況啊，還有沒種引物的TM一般不一樣的，你選擇的時候要看你是用引物的環境，像高溫啊，酸性啊，等等都是你考慮的因素。
還有怎麼選擇才是你研究的對象了，你可以選擇那些符合試驗條件的，然後剔除一些很少用到的，最後一般剩下幾種，然後一一試試，看看那個結果好一點啊，這就是最佳引物了。。。。
引物多種多樣，結構也可能出現你的狀況，其實用軟體農出來的引物還是要你自己去檢驗是不是引物啊，計算機設計不一定就可以，計算機只不過是提供一個指導的作用，所以，不管引物長得怎麼樣，盡管去試試就知道了，不行的話就換其他種。
今天我去問了老師了，這個是正常現象，但是具體的解釋就不是很清楚，因為我們不知道你究竟怎麼弄的，還有這個PRIMER要比那個DNAstar的好很多。

⑽ 關於使用primer 5.0設計PCR引物，哪位哥幫幫我啊，著急啊...

首先設計引物以前的清楚設計引物基本原則例如測序使用引物：測序用引物要求非常嚴格，不同於PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板結合，3』 端的幾個鹼基能完全配對，即使引物長達80~100多個鹼基，只要調整PCR反應條件，也能成功進行PCR反應。
而測序用引物便不一樣了，必須嚴格符合以下要求。無論你使用primer 5.0或者oligo 6.0設計.
●長度在18~25個鹼基左右，一般選擇20個鹼基（根據GC含量作 適當調整)，3』 端盡量選擇G或C鹼基 （但不絕對），以增加與模板的結合能力。
●Tm溫度應選擇50℃~70℃左右。
●GC含量應選擇在50%左右，盡量避開A、T、G、C的連續結構。
●避開引物自身形成發夾結構或引物二聚體結構等復雜結構。
●保證引物和模板100%匹配，特別是3』端的幾個鹼基一定要100%匹配。同時必須嚴格保證引物和模板之間只能有一個結合位點。
這些在使用軟體時已經進行默認無需修改。軟體安裝時已經進行調整.一般遵循以上原則沒有太大問題.在顯示的搜索結果中沒有合適的可以在序列上選取符合設計引物條件的引物.
其次，軟體找出的引物可以進行修改但是不是修改引物序列中的某個鹼基.而是對選出的引物去前或者後末端尋找適合條件引物.最好是你現選出的引物至少符合錯配或者發夾其中一項要求.
以上為測序使用引物設計.如你存在疑問或者需要幫忙設計請發你的序列說明要求互相探討一下.